水稻突变体CA648的相关基因克隆及其功能分析

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株高与分蘖是决定水稻形态建成的两个重要农艺性状。近年来,与水稻株高、分蘖等性状相关的分子生物学研究取得了许多新成果,但株高、分蘖等农艺性状受多基因控制,目前研究成果还远未阐明这些性状的发育机理。本论文以从中花11(ZH11)的T-DNA插入突变体库筛选到的一个矮杆多分蘖突变体CA648为材料,分析了其生理、遗传特性,并开展了分子克隆、遗传转化等相关试验,旨在克隆引起CA648突变性状相对应的基因并探明该基因在水稻株高、分蘖等性状发育过程中的功能。主要结果如下:1.与野生型ZHl 1相比,突变体CA648主要表现出矮化、多分蘖、花期延迟、穗长较短等农艺性状;CA648的株高受种植生境及植物生长调节剂处理等因素影响,但其多分蘖特性非常稳定。2.将CA648与ZH1 1杂交后所得F1代材料的株高、分蘖数、主穗长、每穗总粒数和饱满粒数等性状均介于两亲本之间;F2代材料中所有抗PPT (T-DNA携带BAR抗性基因)株系均表现出矮化多分蘖特性,且抗性株系与非抗性株系数目之比符合孟德尔3:1分离规律,表明CA648突变性状与插入的T-DNA抗性共分离,且其性状改变可能是由单基因位点突变造成的。Southern杂交结果进一步表明CA648为T-DNA单拷贝插入。3.旁侧序列分析表明T-DNA插入水稻突变体CA648的基因组第8“染色体上一个功能未知的基因中间且该基因无内含子,本论文将该基因命名为OsDMT (Oryzq sativa mutants with a characteristics of Dwarfism and Multi-Tiller);在OsDMT基因下游约3.3 Kb处存在一个OsmiR156家族的OsMIR156f基因。4.生物信息学分析表明OsDMT基因编码66个氨基酸,含有蛋白酶抑制剂I家族的保守域。在CA648中组成型过表达OsDMT基因后,能够使其突变性状回复到与野生型ZH11类似的表型。采用RNAi下调ZH1 1中的OsDMT基因后,获得了表型类似于CA648突变性状的转基因株系。5.序列比对分析显示粳稻日本晴的基因组中存在1个包含OsDMT基因在内的长为13003 bp的串联重复序列片段,而籼稻9311基因组中没有重复。对147份不同水稻材料(品种)进行该片段的不同拷贝数变异分析结果显示,仅13份粳稻材料(包括ZH11)中存在2个拷贝,而其余的所有93份籼稻及41份粳稻材料中均仅存在1个拷贝。因此,该包含OsDMT基因在内的13003 bp长的片段可作为不同水稻品种间不同拷贝数变异的CNV区间。6.茎环RT-PCR分析表明,CA648与ZHl 1之间的OsmiR156存在差异。分别在日本晴、中花11中组成型过表达OsMIR156f均获得了与CA648性状类似或表型突变更严重的转基因材料株系。表达模式分析显示OsMIR156f只在分蘖节部位的可伸长蘖芽中表达、而高节位的蘖芽(休眠芽)中不表达。利用Ubiquitinl启动子在水稻中组成型过表达OsMIR156f后导致转基因材料分蘖显著增多,且所有高节位的蘖芽均可伸长;当利用启动子D18将OsMIR156f基因在茎杆中特异过表达后,转基因材料分蘖节上的分蘖数增加而高节位上的蘖芽处于休眠状态。以盆栽试验单本种植的转基因水稻材料进行产量相关性状调查表明,利用D18启动子将OsMIR156f基因在茎杆中特异表达后可适量增加水稻的有效分蘖数而其他性状几乎不受影响。上述结果为今后利用OsMIR156f和OsDMT调控水稻分蘖来改良株型和提高产量提供了理论依据。
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