食管鳞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其预后差,死亡率高,浸润,转移是食管鳞癌患者重要的死亡因为。目前手术、化疗、放疗、等方法是现代医学治疗本病的常用手段,而放疗、化疗疗效因其毒副作用大也不能令人满意；传统医学虽然毒副作用小,但其作用慢而短期效果欠佳,所以,寻找中西医结合方法可能是治疗本病的理想途径。　　 恶性肿瘤的浸润,转移是一个多基因调控、多因素作用、多步骤的复杂过程；其中,真核细胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor4E,eIF4E)、乙酰肝素酶即肝素(heparanase,HPA)、血管内皮生长因子(vascular edothelial growth facter,VEGF)被证实与肿瘤侵袭转移有较为密切的关系。肿瘤的浸润,转移赖依丰富的血管形成,而新生血管的形成往往需要以下过程:①首先要有局部毛细血管基底膜降解；②然后血管内皮细胞进行迁移并伴随细胞增殖；③最终内皮细胞形成新的毛细血管。因此,阻断其中任何环节都将会阻止肿瘤血管的形成,进而防止肿瘤浸润,转移。有研究表明,eIF4E可激活细胞内一些重要蛋白水解酶的表达并促进癌症的转移；而这类酶具有介导免疫反应、参与破坏细胞外基质等作用,且种类较多；其中,HPA是一种葡萄糖醛酸内切酶,是硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)唯一的降解酶；由于HSPG是广泛存在于细胞表面、细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)和血管基底膜(basement　　 membrane,BM)中,并能与血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basiefibroblast growth factor,bFGF)等生物活性分子相互结合、相互作用；而这些生长因子中,VEGF又是某些肿瘤细胞分泌的,并能与血管内皮上受体结合,可诱导肿瘤血管生成,维持肿瘤继续生长的重要血管生成因子；所以,当HPA对HSPG降解后,直接破坏ECM和BM,于是上述生长因子被激活并释放出来,进而产生一系列的生物学现象如炎症反应、血管生成等,促进肿瘤的浸润、转移发展。　　 人参皂甙Rg3是从人参中提取的单体成分,是人参中的重要成分,代号Rg3。研究表明Rg3具有抑制新生血管的生成,抑制肿瘤生长,抗肿瘤转移和浸润,增效解毒,提高机体免疫力等作用,可以作为肿瘤的辅助性治疗,并对防止术后,放化疗后,恶性肿瘤复发和转移的治疗带来广阔前景,但其机制迄今尚不十分清楚。目前,关于Rg3对食管癌疗效研究较少,其对食管癌eIF4E、VEGF及HPA　　 mRNA及蛋白表达的影响尚未见系统的研究报道,特别是其与食管癌eIF4E的关系研究未见报道。　　 为了探讨Rg3对食管癌eIF4E、VEGF及HPA mRNA与蛋白的影响及Rg3在食管癌治疗中的应用价值,本研究采用原位杂交(in siru hybridization,ISH)方法检测Rg3处理食管癌EC9706细胞后eIF4E、VEGF,HPAmRNA的表达；采用免疫细胞化学方法检测Rg3处理食管癌EC9706细胞后eIF4E,VEGF,HPA蛋白的表达；运用Boyden chamber侵袭试验检测Rg3处理食管癌EC9706细胞后细胞体外侵袭力的变化；采用原位杂交方法检测食管癌移植瘤组织中eIF4E、VEGF、HPA mRNA的表达；采用免疫组化方法检测食管癌移植瘤组织中eIF4E,VEGF、HPA蛋白的表达。通过上述实验,以期阐明Rg3对eIF4E、VEGF、HPA的影响,为临床用药治疗食管癌等恶性肿瘤提供实验依据。　　 为了进一步探讨Rg3抗食管癌的浸润、转移疗效,本研究观察了60例晚期食管鳞癌的患者,采用参一胶囊辅助GP方案治疗晚期食管癌30例,与单纯GP方案化疗组30例相对照,观察了参一胶囊辅助GP方案治疗晚期食管癌疗效。本研究分以下三个部分。　　 方法：　　 1.食管癌EC9706细胞培养:食管癌EC9706细胞以10％胎牛血清培养液在37℃、5％CO2条件下贴壁培养。　　 2.实验分组:分空白对照组、Rg3组(低、中、高浓度组)、DDP组、DDP+Rg3组,设24h、48h、72h三个处理时间段。　　 3.eIF4E、VEGF及HPA mRNA及蛋白表达水平检测和EC9706细胞侵袭力检测:　　 3.1采用原位杂交方法检测Rg3对食管癌EC9706细胞中eIF4E,VEGF、HPAmRNA表达影响。　　 3.2采用免疫细胞化学方法检测gg3对食管癌EC9706细胞中eIF4E、VEGF,HPA蛋白表达影响。　　 3.3采用Boyden chamber体外侵袭试验检测Rg3对食管癌EC9706细胞的体外侵袭能力变化的影响。　　 4.统计学处理:应用SPSS16.0统计软件进行统计学处理,资料用均数±标准差((x)±s)表示；两组均数的比较用t检验(t-test),两组以上均数的比较采用方差分析,显著性水准a=0.05。　　 结果：　　 1.原位杂交结果:　　 ①浓度不同、作用时间相同各实验组EC9706细胞中eIF4E、VERF、HPAmRNA表达均有不同程度抑制作用,各实验组与空白对照组两两相比均有统计学意义(P均<0.01),其中以联合组抑制作用为最强；每个时间点3个浓度Rg3的抑制作用随Rg3剂量增加而增强,其中以60μg/mlRg3浓度抑制效应较为明显,但Rg3低、中浓度组相比,无显著性差异妒>0.05),其余两两相比,有显著性差异(P均<0.05)。　　 ②在eIF4E、HPA mRNA研究中,各浓度Rg3对eIF4E、HPA mRNA表达抑制效应均低于顺铂组和联合组,均有显著性差异(P均<0.05),而联合组对eIF4E、HPA mRNA表达抑制效应均高于各实验组,但是与顺铂组相比,无显著性差异(P>0.05),其余两两相比,均有显著性差异(P均<0.05)；在VEGF mRNA研究中,各浓度Rg3对VEGF mRNA表达抑制效应均高于顺铂组,均有显著性差异(p均<0.05),而联合组对VEGF mRNA表达抑制效应均高于各实验组,但和高浓度Rg3组相比,无显著性差异(P>0.05),而和顺铂组及低、中浓度Rg3组相比,有显著性差异(P均<0.05)。　　 ③浓度相同、作用时间不同各实验组作用EC9706细胞24h、48h、72h后,eIF4E、VEGF、HPA mRNA表达量均逐渐有所降低,以72h时间点的降低最为明显；浓度相同各实验组在不同时间点抑制效应两两相比,均有显著性差异(P均<0.05)。　　 2.免疫细胞化学结果:　　 ①浓度不同、作用时间相同各实验组对EC9706细胞中eIF4E、VERF、HPA蛋白表达均有不同程度抑制作用,各实验组与空白对照组两两相比均有统计学意义(P均<0.01),其中以联合组抑制作用为最强；每个时间点3个浓度Rg3的抑制作用随Rg3剂量增加而增强,其中以60μg/mlRg3浓度抑制效应较为明显,但Rg3低、中浓度组相比,无显著性差异(P>0.05),其余两两相比,有显著性差异(P均<0.05)。　　 ②在eIF4E、HPA蛋白研究中,各浓度Rg3对eIF4E、HPA蛋白表达抑制效应均低于顺铂组和联合组,均有显著性差异(P均<0.05)；而联合组对eIF4E、HPA蛋白表达抑制效应均高于各实验组,但和顺铂组相比,无显著性差异(P>0.05),其余两两相比,均有显著性差异(P均<0.05)。在VEGF蛋白研究中,.各浓度Rg3对VEGF蛋白表达抑制效应均高于顺铂组,均有显著性差异,(p均<0.05),而联合组对VECF蛋白表达抑制效应均高于各实验组,但和高浓度Rg3组相比,无显著性差异(P>0.05),而和顺铂组及低、中浓度Rg3组相比,有显著性差异(P均<0.05)。　　 ③浓度相同、作用时间不同各实验组作用EC9706细胞24h、48h、72h后,eIF4E、VEGF、HPA蛋白表达量均逐渐有所降低,以72h时间点的降低最为明显；浓度相同各实验组在不同时间点抑制效应两两相比,均有显著性差异(P均<0.05)。　　 3.Boyden chamber体外侵袭试验结果:　　 Rg3、DDP、Rg3+DDP作用食管癌EC9706细胞后,穿越Matrigel的细胞数均少于空白对照组,联合组尤为明显,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组分别与Rg3组、DDP组比较差异有显著意义(P均<0.05)。　　 第二部分人参皂甙Rg3对裸鼠食管鳞癌移植瘤中eIF4E、VEGF、HPA mRNA与蛋白表达影响的研究　　 方法：　　 1.食管癌EC9706细胞培养:方法同第一部分1。　　 2.分组培养:方法同第一部分2。　　 3.浓度为60μg/ml的Rg3、浓度为10μg/ml的DDP和浓度为60μg/ml的.Rg3+浓度为10μg/ml的DDP处理EC9706细胞24h,另设对照组(未作任何处理)。分别采用裸鼠右前腿腹侧皮下注射方式(注射2×106个细胞/只)进行裸鼠体内成瘤实验,连续饲养5w。　　 4.瘤重和抑瘤率　　 脱颈椎处死小鼠后,取出肿瘤组织,精确电子天平秤取瘤重,按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率(％)=[对照组平均瘤重(g)-实验组平均瘤重(g]/对照组平均瘤重(g)×100％。　　 5.采用原位杂交方法检测Rg3对裸鼠食管癌移植瘤组织中eIF4E、VEGF,HPAmRNA表达的影响。　　 6.采用免疫组化方法检测Rg3对裸鼠食管癌移植瘤组织中eIF4E,VEGF,HPA蛋白表达的影响。　　 7.统计学处理:所有数据均采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理,计量资料采用(x)±s表示,多组均数的比较采用方差分析。显著性水准a=0.05。　　 结果：　　 1.瘤重和抑瘤率　　 Rg3组瘤重与空白对照组比无显著性差异(P>0.05),其余各实验组瘤重均低于空白对照组,均有显著性差异(P均<0.05)；联合组均低于Rg3组和顺铂组,两两比较均有显著性差异(P均<0.05)；顺铂组瘤重低于Rg3组,有显著性差异(P<0.05)；联合组抑瘤率较Rg3组、顺铂组明显,两两比较均有统计学意义(P均<0.05)。　　 2.原位杂交结果:　　 本研究应用原位杂交技术检测发现:①各实验组对裸鼠皮下移植瘤中eIF4E、VERF、HPAmRNA表达均有抑制作用,以联合组抑制作用为最强,各实验组与空白对照组相比均有统计学意义(P均<0.01)；②联合组抑制作用均高于Rg3组和顺铂组.均有统计学意义(P<0.01、P<0.05)；③在eIF4E、HPA mRNA研究中,顺铂组抑制作用高于Rg3组,有显著性差异(P<0.01)；在VEGF mRNA研究中,Rg3组抑制作用则高于顺铂组,有显著性差异(P<0.05)。　　 3.免疫组化学结果:　　 本研究应用免疫组化技术检测发现:①各实验组对裸鼠皮下移植瘤中eIF4E、HPA蛋白表达均有抑制作用,以联合组抑制作用为最强,各实验组与空白对照组相比均有统计学意义(均.P<0.01)；②联合组抑制作用均高于Rg3组和顺铂组,均有统计学意义(P<0.01或.P<0.05)；③在eIF4E、HPA蛋白研究中,顺铂组抑制作用高于Rg3组,有显著性差异(P0.05)；　　 2.两组治疗后血清血管内皮生长因子(VEGF)均有下降,但治疗组下降更明显,两组比较有统计学意义(P<0.01)；　　 3.治疗组白细胞和血小板下降率、恶心呕吐发生率均低于对照组,两组差异显著(P均<0.05)；　　 4.治疗组生活质量改善方面明显优于对照组,两组比较差异显著(P<0.05)；　　 5.3个月、6个月生存率治疗组高于对照组,但两组比较无统计学意义(P>0.05),1年生存率治疗组高于对照组,两组比较有显著性差异(P<0.05)。　　 结论：　　 1.3种不同浓度的人参皂甙Rg3均表现出对EC9706细胞中eIF4E、VEGF,HPA蛋白及mRNA表达的抑制作用,提示人参皂甙Rg3可通过抑制eIF4E,VEGF,HPA蛋白及mRNA表达,从而抑制食管癌浸润转移,为临床和实验性抗肿瘤转移的治疗提供理论依据,为临床预防食管癌复发转移提供了一种新的用药途径。.　　 2.随着人参皂甙R移用药浓度、时间增加,对EC9706细胞中eIF4E,VEGF,HPA蛋白及mRNA表达的抑制作用也逐渐增强,提示人参皂甙Rg3对EC9706细胞中eIF4E,‘VEGF,HPA蛋白及mRNA表达的抑制作用与其浓度、作用时间有依赖性。　　 3.人参皂甙Rg3与顺铂联合对EC9706细胞中eIF4E,HPA蛋白及mRNA表达的抑制有一定协同作用,但协同作用不很明显,而对EC9706细胞中VEGFmRNA与蛋白表达的抑制则有明显协同作用,提示人参皂甙Rg3在抑制肿瘤新生血管生成作用方面占优势,并优于顺铂。　　 4.Boyden chamber体外侵袭实验结果提示:人参皂甙Rg3具有抑制肿瘤细胞侵袭作用。　　 5.人参皂甙Rg3对食管鳞癌裸鼠皮下移植瘤的生长无明显抑制作用,但和化疗药联合使用则有协同抑制作用。　　 6.人参皂甙Rg3可显著下调裸鼠食管鳞癌移植瘤组织中eIF4E、VEGF、HPAmRNA及蛋白表达,提示人参皂甙Rg3在体内有抑制eIF4E、VEGF、HPA mRNA及蛋白表达的作用。　　 7.人参皂甙Rg3与顺铂联合应用对裸鼠食管鳞癌移植瘤组织中eIF4E、VEGF、HPA mRNA及蛋白表达的抑制均强于任何单药组,提示人参皂甙Rg3与顺铂联合应用具有协同作用。　　 8.人参皂甙Rg3在抑制血管内皮生长因子(VEGF)作用方面,体内外实验相一致,提示人参皂甙Rg3可能主要是通过抑制肿瘤新生血管生成而起到抑制肿瘤浸润转移的作用。　　 9.人参皂甙Rg3辅助化疗治疗晚期食管癌,可以提高化疗总有效率,提示人参皂甙Rg3与化疗药具有协同作用,这与体内外实验有一致之处。　　 10.人参皂甙Rg3具有降低食管癌血清VEGF水平作用,提示人参皂甙Rg3具有抑制食管癌新生血管形成并阻止其浸润转移的作用,这与体内外实验相一致。　　 11.人参皂甙Rg3具有减轻化疗的毒副作用的功效,具有保护骨髓的功效。　　 12.人参皂甙Rg3具有提高晚期食管癌患者的生活质量、生存率的作用并具有延长患者生存期的功效。　　 本研究创新点:　　 1.本实验首次采用人参皂甙Rg3处理EC9706细胞,应用原位杂交、免疫组化技术观察了人参皂甙Rg3对EC9706细胞中eIF4E、VEGF、HPA mRNA及蛋白表达的影响,为进一步临床和实验性抗肿瘤转移的治疗提供理论依据。　　 2.本实验首次观察了人参皂甙Rg3对裸鼠食管鳞癌移植瘤组织中eIF4E、VEGF,HPAmRNA及蛋白表达的影响,为进一步临床和实验性抗肿瘤转移的治疗提供了理论依据。　　 3.首次进行了人参皂甙Rg3辅助GP方案治疗晚期食管癌的疗效观察,并与GP方案治疗相比较,初步揭示了人参皂甙Rg3抗晚期食管鳞癌浸润、转移的临床疗效,为临床预防食管鳞癌复发转移提供了一种新的用药途径。