目的：　　T1D是一种自身免疫性疾病，患者的胰岛β细胞不断受到自身免疫性攻击，分泌的胰岛素不能满足患者最基本的需求量，出现血糖升高症状；患者本身有易感性遗传背景、机体免疫耐受缺失、以及环境因素是发病的主要原因。目前用外源性胰岛素补充T1D患者的胰岛素需求是T1D治疗的主要手段，现今胰岛素制剂和注射方式与以前相比有了很大的改善,但是 T1D 患者因糖尿病引起的急、慢性并发症仍难以避免；尤其是疾病后期，胰岛细胞功能完全丧失衰竭时，可导致脆性糖尿病的发生，此时患者的生活质量受到严重危害。鉴于以上原因,目前T1D的免疫干预和治疗越来越受到更多研究者的重视。一直以来，T1D 被认为是 T细胞介导的自身免疫性疾病；越来越多研究发现，B细胞和体液免疫调节在T1D的发生及发展中也起着至关重要的作用。抗-CD20 单克隆抗体(Anti-CD20mAb)能与B淋巴细胞表面的CD20分子高亲和力结合，是作用于CD20分子的特异性单克隆抗体,Anti-CD20mAb能够清除体内的B淋巴细胞,从而使B淋巴细胞绝对数量大幅减少；但是Anti-CD20mAb不会造成B淋巴细胞的永久性缺失。白细胞介素-10（IL-10）主要来源于 Th2 细胞、单核细胞和巨噬细胞, 是重要的抗炎活性强大的炎症调节细胞因子之一，可以通过多种途径抑制炎症免疫过程中的多个环节，发挥免疫抑制功能。由于抗CD20单克隆抗体和IL-10能分别调节体液免疫及细胞免疫平衡，本实验研究用抗CD20单克隆抗体及腺病毒介导的白细胞介素10（Ad-mIL-10）联合免疫治疗新发病的非肥胖型糖尿病( NOD)小鼠，观察联合治疗对NOD小鼠胰岛β功能的影响，并通过对NOD小鼠脾脏CD4+、CD8+、CD4+CD25+ Foxp3+Treg T细胞亚群及转录因子T-bet、GATA-3研究，探索其免疫调节机制。　　方法：　　1、细胞实验：由于天然的IL-10半衰期短，要达到治疗效果需要频繁注射，为此我们课题组前期已成功构建能够有效表达 IL-10 的 IL-10 基因质粒（Ad-mIL-10），此基因质粒由腺病毒介导。将含 IL-10 基因重组腺病毒和不含IL-10基因的空病毒载体（Ad-EGFP）转染人胚肾293（HEK293）细胞，富集、扩增、纯化含有 IL-10基因的 Ad-mIL-10及不含有 IL-10基因 Ad-EGFP重组腺病毒，然后将病毒滴定 1× 1011pfu/ml 备用于动物实验。2、动物实验：选取鼠龄为17-20周，且新近1周以内发生糖尿病的雌性 NOD小鼠作为研究对象。小鼠共计 30 只被随机分为 5 组：3 个治疗组分别是 Anti-CD20mAb 治疗组、Anti-CD20mAb+Ad-mIL-10联合治疗组、Ad-mIL-10治疗组；2个对照组为空载体Ad-EGFP组和生理盐水对照组，每组各有小鼠 6只。在治疗开始的第 1天、第3天、第6天和第9天尾静脉分别注射Anti-CD20mAb、Ad-mIL-10、Ad-EGFP和生理盐水。Anti-CD20mAb用法：第1天注射500μg，第3、6、9天注射250μg；Ad-mIL-10、Ad-EGFP 和生理盐水用法：第1、3、6、9天各注射0.1ml。3、末次用药后 6 周无菌摘除双侧眼球取全血，留取小鼠血清样本，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中的C肽和的细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的含量。取全血后将小鼠断颈处死，立即将小鼠的脾脏取出，用于以下各项检测：一部分制成脾细胞悬液用流式细胞术（FACS）检测小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例，并根据 CD4+和 CD8+T 细胞的百分比算出CD4+/CD8+的比率；用免疫组化及Western Blot法检测CD20 及IL-10在脾脏的表达；NOD小鼠脾脏中转录因子T-bet、GATA-3的表达以及细胞因子IL-4、IFN-γ基因的表达采用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）进行检测。　　结果：　　①转染Ad-mIL-10和Ad-EGFP的人胚肾293细胞明显表达绿色荧光，两种病毒用同一试剂盒滴定，浓度均为1× 1011pfu/ml。　　②与Ad-EGFP和生理盐水组相比，治疗组血清中C肽、IL-4 和IL-10水平明显增加，而血清IFN-γ水平显著降低，差异有统计学意义。　　③治疗组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例明显升高，计算得出的CD4+/CD8+的比率明显降低，与Ad-EGFP和生理盐水组相比差异有统计学意义。　　④免疫组化结果与Western Blot结果显示，治疗组与Ad-EGFP和生理盐水对照组相比，CD20在脾脏的表达无明显差异，各治疗组之间比较亦无明显差异。而各个治疗组小鼠脾脏IL-10的表达明显高于对照组，联合治疗组 IL-10 的表达高于单独治疗组，差异有显著性。　　⑤Anti-CD20mAb+Ad-mIL-10联合治疗组与Ad-EGFP、生理盐水对照组相比，小鼠脾脏GATA-3 和IL-4 mRNA的表达显著增加, 而T-bet和IFN-γmRNA的表达明显降低。　　结论 ：　　①腺病毒介导IL-10基因在NOD小鼠脾脏表达增加。　　②对新发病NOD小鼠采用Anti-CD20mAb+ Ad-mIL-10联合治疗，可增加血清C肽水平，提示联合治疗有保护NOD胰岛β细胞功能的效用。　　③抗CD20单克隆抗体与白细胞介素10(IL-10) 联合治疗增加脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例，使CD4+/ CD8+的比率降低；可上调小鼠脾脏中转录因子GATA-3 和IL-4的表达，下调T-bet、IFN-γ的表达，表明Anti-CD20mAb +Ad-mIL-10联合治疗可使NOD小鼠自身的免疫微环境改善，从而发挥免疫治疗T1D的效用。　　④联合治疗可能通过调控T-bet和GATA-3的表达，调节IFN-γ、IL-4和IL-10细胞因子的分泌，影响机体CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+T、CD8+T细胞亚群及Th1和Th2细胞亚群的平衡，从而保护残存的胰岛功能。