人参中PgRFK与PgEXO70B1的表达分析及其功能的初步探究

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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)作为我国一味传统的中药材,吉林省的主要道地药材之一,已有悠久的利用历史。现代研究表明,作为人参活性物质之一的人参皂苷Rb1具有调节神经系统、保护心血管系统、延缓衰老等药理活性,同时对肿瘤及糖尿病等疾病的治疗发挥着重要作用。人参生长周期长,皂苷产量较低,随着市场对人参相关产品的需求日益增加与现代生物技术的迅速发展,在分子水平深入挖掘人参皂苷Rb1生物合成的关键基因资源,具有极其重要的理论与实践意义。本研究通过分析人参转录组数据库获得人参皂苷Rb1生物合相关的基因群,命名为PgRb1(A2),并对它们的表达模式进行分析。将PgRb1(A2)与已获得功能验证的16个关键酶基因进行基因表达互作网络分析,发现PgRb1(A2)与这些基因之间存在紧密的联系;同时,通过与人参皂苷Rb1含量进行相关性分析,在PgRb1(A2)基因群中进一步获得与人参皂苷Rb1含量紧密相关的重要候选基因PgRb1S05和PgRb1S08。利用qRT-PCR技术分析茉莉酸甲酯诱导下PgRb1S05和PgRb1S08基因的表达量与人参皂苷含量的相关性,验证上述分析的准确性。进而通过基因克隆和DNA重组技术分离并验证PgRb1S08基因的生物学功能,通过原核表达系统成功表达PgRb1S05酶蛋白。所得的结果如下:1.通过对人参皂苷Rb1合成相关PgRb1(A2)基因群的进行表达分析,发现PgRb1(A2)基因群中各基因的表达与Rb1含量呈显著相关,且分属与不同蛋白家族,具有各自的表达特性。2.通过将PgRb1(A2)与已获得功能验证的16个关键酶基因进行基因表达互作网络分析,发现PgRb1(A2)与16个关键酶基因之间存在紧密的联系,且随着Rb1含量的增高,基因与基因间的联系愈加紧密,参与的基因数目越来越多,筛选出与Rb1高含量组相关的重要候选基因PgRb1S05与PgRb1S08。3.茉莉酸甲酯诱导的人参发状根中的总皂苷与单体皂苷Rb1均呈现了显著的升高,qPCR的检测表明,PgRb1S05与PgRb1S08在不同皂苷含量下的基因的表达规律与基于转录组数据库的分析结果一致。4.通过基因克隆技术分离得到PgRb1S08基因的全长序列,其长度为1836bp,编码515个氨基酸,通过相关生物信息学预测分析,其编码的蛋白具有典型的胞泌复合体结构,与拟南芥中胞泌复合体EXO70B1蛋白亚基基因的同源性最高,拟南芥原生质体亚细胞定位表明该蛋白主要定位在胞质中,与预测的结果一致,通过农杆菌介导法,获得转基因拟南芥T2代植株,且在该代拟南芥中表现出促进气孔打开的特性。5.通过3’RACE与PCR技术获得了PgRb1S05的全长序列,其长度为1200bp,编码399个氨基酸,通过序列比对得出,该蛋白为人参中的核黄素激酶,为多功能蛋白,并成功的构建该基因的原核表达载体,通过Western鉴定该蛋白成功在大肠杆菌中表达,为该蛋白功能的深入研究奠定基础。
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