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第一部分:骨髓基质细胞来源的血管内皮祖细胞的诱导、分化和鉴定目的:通过贴壁培养法获取骨髓基质细胞,并在骨髓基质细胞中加入诱导剂,培养血管内皮祖细胞。方法:取幼年雄鼠的股骨,通过贴壁培养的方法获取骨髓基质细胞,传代至第三代细胞通过流式细胞仪鉴定CD90、CD31、CD34的表达率,在培养基中加入VEGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml),接种密度为30%,培养5天时,利用流式细胞仪鉴定CD133、CD34、FLK-1表达率,并利用PCR技术,鉴定这种细胞eNOS基因的表达。结果:第三代MSCs的CD90阳性率99%、CD31阳性率3.4%、CD34阳性率0.3%,诱导培养的血管内皮祖细胞CD133的表达率52%、CD34的表达率33%、FLK-1的表达率38%。经PCR技术显示诱导后的细胞可特异性表达eNOS。结论:利用贴壁培养法获取骨髓基质细胞简便易行,取得的细胞经鉴定为骨髓基质细胞。进一步,经诱导培养的骨髓基质细胞能特异性表达血管内皮祖细胞的表型,并具有内皮祖细胞的功能。第二部分:挫伤脑组织提取液对血管内皮祖细胞趋化性的体外研究目的:研究经骨髓基质细胞诱导培养的血管内皮祖细胞对创伤脑组织提取液的归巢特性。方法:将血管内皮祖细胞设为实验对象,置于Transwell上室,将骨髓基质细胞与成纤维细胞(3T3细胞)设为对照组,置于Transwell上室,细胞培养箱中静置30分钟,利用DAPI观察下室中存在的活细胞数目,下室中细胞趋化液按浓度分为30%,20%和10%组,并设立一个标准细胞培养液组。结果:血管内皮祖细胞和骨髓基质细胞较3T3细胞对30%,20%,10%的创伤脑组织提取液的过膜细胞数明显增加(p＜0.05),在对损伤液的趋化性上这两者细胞未见明显区别。血管内皮祖细胞对于创伤脑组织提取液的趋化程度随着提取液的浓度增加而增加。结论:1)在体外实验中,BPCs较3T3细胞对于脑组织损伤提取液有明显的趋化能力。2)BPCs与MSCs对创伤脑组织提取液有相似的趋化能力。3)创伤脑组织提取液浓度越高,对EPCs的趋化能力越强。4)在创伤脑组织提取液中包含许多的炎性介质,这些因子有利于趋化细胞至损伤处。第三部分:MSCs来源的EPCs体内移植治疗脑外伤大鼠的研究目的:通过将获得的骨髓基质细胞来源的血管内皮祖细胞经尾静脉移植至创伤性脑损伤大鼠体内,观察细胞在体内的归巢情况,并研究这种细胞对脑损伤的治疗作用和治疗原理。方法:1.建立大鼠液压冲击脑损伤模型:以前囟与人字缝中点,矢状线左侧2.5mm为中心致伤,冲击压力为1.3～2.0atm。2.实验动物分组:成年雌性大鼠,体重280-300g,随机分为4组:第一组为实验组:创伤性脑损伤后24小时移植移植2×10~6EPCs,第二组为对照组1:创伤性脑损伤后24小时移植移植2×10~6MSCs,第三组为对照组2:创伤性脑损伤后24小时移植移植2×10~6 3T3细胞,第四组为对照组3:假伤后24小时移植移植2×10~6EPCs。3.细胞移植:移植的EPCs与MSCs来源于体重120～150g雄性大鼠,移植细胞前24小时按20μmol/L的终浓度加入Brdu,移植前用PBS沈涤,将细胞密度调至4×10~6/ml。细胞经大鼠尾静脉移植。4.行为学观察:对脑损伤后大鼠以mNSS标准进行伤后神经功能评价。5.组织学观察:取大鼠脑组织、心、肺、肝、脾、肾。脑组织以创伤为中心切取2个组织块,并向前后各延一个组织块。体部组织各取一组织块。切片行HE染色及Brdu+BDNF、Brdu+Ⅷ因子。6.荧光原位杂交,利用雄鼠特异性基因Sry片断设计检测探针,监测组织中的雄鼠来源的细胞在伤后雌鼠体内的细胞分布。结果:1.脑损伤模型:致伤各组大鼠死亡率及治疗后第2天神经功能评价无显著性差异。2.神经功能评分:在治疗后的第7天,神经功能障碍情况开始好转,无论是实验组还是对照组的mNSS评分均出现下降,但是实验组与对照组1在7、14、28天的评分无统计学意义,但这两组较3T3细胞移植组来说评分显著下降,有统计学意义。3.脑组织病理改变:各致伤组脑组织HE染色均可见创伤病灶、组织坏死和胶质细胞增生。4.免疫组织化学染色:免疫组化发现实验组及对照组1均可见移植的细胞出现在损伤灶周围,与脑内其他部位相比有统计学意义,而对照组2和假伤细胞移植组在脑损伤灶周围与其他部位脑组织中细胞分布相比未见明显统计学意义。实验组与对照组1相比在损伤灶周围形成较多的血管,而脑源性神经生长因子两组相比未见明显差别。体部各组织中,在实验组和对照组1中的细胞在组织中的分布情况为:肺部占1.6%,肝部占0.3%,心肌占0.002%,肾脏占0.01%,脾脏占0.5%。5.荧光原位杂交观察组织中细胞数目较Brdu阳性的细胞数目明显多,两者相比,后者占前者的30%。结论:1、EPCs通过静脉移植可定向归巢至创伤性脑损伤大鼠损伤灶周围。2、这些细胞能在损伤灶周围明显的修复受损血管、增加血管生成。3、EPCs可同样继承MSCs分泌脑源性神经生长因子的能力。4、EPCs治疗创伤性脑损伤的机理:1)增加血供挽救致伤灶周围濒死神经细胞。2)通过分泌的神经营养因子,改善神经细胞功能。3)通过供血和神经营养作用,促进内源性神经干细胞到达损伤部位,并在该处分化,构建新的神经环路。4)VEGF促进EPCs到达损伤灶,又进一步通过EPCs增加VEGF的分泌,并使EPCs在VEGF的作用下,增加NO的合成和分泌,扩张局部血管,增加脑的血液供应。