论文部分内容阅读
丙型肝炎主要是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染所引起的非甲、非乙型肝炎的主要类型。据世界卫生组织（WHO）估计,目前全世界范围内HCV感染患者大约有1.8亿人,我国属HCV的中高度流行区,感染人数逾4300万人。其中HCV一经感染,约75-85%的感染者会发展为慢性肝炎,超过20%的感染者会发展为肝硬化,并有较大比例的感染者最终发展为肝细胞癌。由于缺乏合适的HCV感染动物模型,HCV致病机制研究及治疗药物与疫苗的研发严重滞后。人和黑猩猩是HCV的自然宿主,但由于社会伦理与资源的限制,不能大量用于丙型肝炎实验研究。树鼩体型小、繁殖快、易操作,基因组、新陈代谢、生理生化等各类指标与和人类比较相似,使得树鼩在生物医学领域得到广泛应用。已有研究及我们的研究发现,活体树鼩与树鼩原代肝细胞（PTH）可被HCV感染,树鼩有望成为合适的丙型肝炎动物模型。然而,目前仍然存在HCV对树鼩及树鼩原代肝细胞的感染率不高、感染不稳定,及相关机制不清等问题,亟待改进相关技术方法,以真正建立丙型肝炎树鼩动物模型。本研究利用二步灌流法分离得到状态较好的PTH,利用已经建立条件可实现细胞的培养生长。用J6-JFH/Huh7.5.1 HCV病毒体外培养体系,可培养得到病毒载量为7.89×107copies/mL的HCV病毒上清。用最适感染复数（MOI）为1.0的HCV病毒感染PTH,隔天收取培养上清和细胞,逆转录-巢式PCR法检测细胞上清,确定培养不同时间上清中HCV病毒的的存在。荧光定量PCR检测发现,HCV感染的PTH不同培养时间,上清中最高达病毒载量可达7X 104copies/mL。通过Western blot检测HCV所感染PTH细胞中HCVNS3蛋白的表达,仅能在感染后第11天和第13天可检测到NS3蛋白的表达。说明HCV可以感染PTH,并在细胞能复制及翻译,但是存在感染效率低和不稳定的缺点。其次,采用生物信息学方法预测树鼩白蛋白启动子序列(PALB)并设计引物,扩增获得含有树鼩白蛋白启动子序列的基因片段,通过测序和Mega6.1软件比对分析,得到树鼩PALB的序列,长度为544bp。对其结构进行分析发现,在-35～-27bp处存在一个TATA-box为:TATAAAT（其序列格式为:TATAWAW,W代表A或T）;在-425～-419bp处存在一个CAAT-box为:CCAAT（其序列格式为:CCAAT）;在-456～-442bp处有一个HNF-1转录因子,从而可以初步判断该启动子序列预测是准确的。随后扩增得到EGFP、hCD81片段及hOCLN片段,经过双酶切、连接的方式成功的构建了两个肝组织特异性载体(Plive-PALB-hCD81-EGFP和Plive-PALB-hOCLN-EGFP)。将所构建的两个肝组织特异性载体,采用脂质体分别共转染PTH和Huh7.5.1,转染后48h采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,发现在PTH细胞中表达绿色荧光蛋白,而剩余两种细胞并未见任何荧光。然后用实时荧光定量PCR方法检测转染PTH细胞中hCD81和hOCLN基因mRNA的表达情况,发现体外所转染成功的PTH细胞中hCD81和hOCLN基因mRNA表达量几乎无变化。同样方法检测体内转染肝组织特异性载体的肝脏中hCD81和hOCLN基因mRNA的表达情况,发现这两个受体表达量未发生改变。从而说明,这两重组肝组织特异性载体没有达到预想的效果。综上所述,采用两步灌流法分离所得树鼩原代肝细胞,用J6/JFH1进行感染。通过核酸和蛋白水平检测后,均证实树鼩原代肝细胞对HCV具有一定的感染性。通过生物信息学方法准确的得到树鼩PALB序列,将树鼩肝组织特异性载体在不同细胞中转染,结果证实这两个载体无效果。肝组织特异性表达载体的构建还有待进一步完善。