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黏菌素又名多黏菌素E，是由多黏芽孢杆菌培养液中提取的碱性环状多肽类抗生素，临床上常用其硫酸盐，但因其具有肾毒性和神经毒性使黏菌素的应用受到很大限制。近年来，由于多重耐药菌的肆虐及对抗多重耐药菌的新药研发有限，而硫酸黏菌素对多重耐药革兰氏阴性杆菌疗效显著，使其又重新得到重视，并在临床应用。但因神经毒性和肾毒性问题仍然存在，所以明确其毒性机制为寻找新的减毒措施，指导临床合理用药具有重要意义。利用体外系统检测神经毒性是一种趋势，在体外用于检测潜在的神经毒性和毒性机制研究的模型很多，尤其是大鼠肾上腺嗜铬骨髓瘤细胞（PC12细胞）被广泛用于神经生物学和神经毒理学的研究。因此本文选用PC12细胞作为研究对象，结合小鼠急性毒性试验选择剂量，初步探讨硫酸黏菌素诱导神经细胞凋亡可能的发生机制。采用寇氏法对18～22g昆明小鼠进行硫酸黏菌素尾静脉注射的急性毒性试验，观察急性毒性对血常规、血生化指标以及肝肾等器官的影响。根据急性毒性实验结果，选择有中毒症状，但与对照组相比，血常规和血生化指标、肝肾组织结构无显著性差异的剂量(1mg·mL-1硫酸黏菌素)，作为体外细胞毒性实验的最高剂量。再结合细胞活力测定（MTT）试验，AO/EB双荧光染色、Hoechst33258染色、透射电镜观察超微结构、LDH水平检测、ROS含量测定，筛选出250、125、62.5μg·mL-1硫酸黏菌素用于后续试验。罗丹明123染色流式细胞仪观察线粒体膜电位的变化及PI单染检测细胞凋亡周期，试剂盒法测定caspase-3、caspase-9的活性、DNA Ladder法检测DNA片段等方面观察硫酸黏菌素诱导PC12细胞凋亡情况。检测细胞内、外游离Ca2+浓度变化，Western-blot法检测凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2、细胞色素C、Fas、FasL、GnRP78、caspase-3、caspase-8、caspase-9和caspase-12的表达，实时定量PCR染料法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12的表达，从诱导凋亡的三条经典信号途径推导出硫酸黏菌素诱导PC12细胞凋亡的机制。试验结果如下：（1）MTT、LDH试验证明硫酸黏菌素对PC12细胞有强烈的毒性，表现为细胞存活率降低，LDH释放随时间和剂量的增加而升高。（2）通过倒置显微镜、荧光显微镜和透射电镜的观察发现125、250μg·mL-1硫酸黏菌素可引起PC12细胞突起变短，胞浆内有空泡形成，细胞核固缩，核碎片增多，线粒体肿胀、并伴有空泡化，内质网核糖体释放等典型的凋亡特征出现且具有剂量依赖性关系。（3）硫酸黏菌素能使ROS活性升高，破坏机体的抗氧化系统，导致氧化应激，造成PC12细胞发生氧化损伤，并且具有剂量-效应关系和时间-效应关系，说明氧化应激可能是硫酸黏菌素的神经毒性机制之一。（4）流式细胞仪检测发现125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能降低线粒体膜电位，干扰DNA正常合成过程，造成细胞在S期阻滞，引起DNA链断裂，由此启动了以剂量依赖关系诱导的PC12细胞凋亡程序。（5）DNA Ladder检测、caspase-3、caspase-9活性变化等结果显示，125、250μg·mL-1剂量组硫酸黏菌素可引起DNA链断裂，导致DNA损伤，引起caspase-3、caspase-9活化程度显著增强，并有剂量、时间依赖关系。（6）通过Western-blot法发现125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使p53、细胞色素C、Bax、caspase-9和caspase-3表达显著增加，Bcl-2表达显著减少，说明硫酸黏菌素通过损伤细胞DNA诱导并激活p53，并进一步引起Bax表达增加，Bcl-2表达减少，导致Bax/Bcl-2比值升高，细胞色素C等促凋亡物质释放入胞质，引起caspase-9的释放，最后激活caspase-3通过线粒体途径导致细胞凋亡的发生。（7）通过Western-blot法观察到125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使PC12细胞中Fas、FasL、caspase8表达显著增加，说明硫酸黏菌素引起Fas、FasL受体表达增加，导致caspase-8释放增加，最后激活caspase-3，通过死亡受体途径诱导细胞凋亡的发生。（8）125、250μg·mL-1硫酸黏菌素能使PC12细胞内[Ca2+]i浓度升高，细胞培养液中[Ca2+]i浓度降低，使钙稳态被破坏，Western-blot法显示内质网伴侣蛋白GnRP78表达增多，caspase-12释放增加，最后也激活caspase-3，通过内质网途径诱导细胞凋亡的发生。（9）通过实时荧光定量PCR方法检测PC12细胞中caspase-8、caspase-9、caspase-12基因的表达水平，发现硫酸黏菌素诱导的PC12细胞凋亡主要由死亡受体途径引起，接下来是线粒体途径，最后内质网途径是。综上所述，高浓度的硫酸黏菌素在体外能够导致PC12细胞形态结构改变，并导致神经元细胞内氧化应激反应，通过死亡受体、线粒体、内质网三条途径诱导PC12细胞凋亡，导致中枢神经系统损伤，引发其神经毒性，提示细胞凋亡可能在硫酸黏菌素所致神经毒性中起了重要的作用。