脑卒中是严重威胁人类健康和生命的常见病之一,具有患病率高、复发率高、致残率高和死亡率高的特点,目前已成为世界公认的第三大致死性疾病。脑卒中可导致躯体、行为、认知和情感障碍。脑卒中分为两类:缺血性卒中和出血性卒中。在我国缺血性卒中所占的比率为60%～80%。缺血性卒中患者即使经过治疗,仍有约四分之三的患者残留不同程度的神经功能障碍,临床表现为肢体无力、偏瘫、感觉障碍、语言障碍、视觉障碍、共济失调等。缺血性卒中不仅引起感觉、运动功能障碍,还可能导致认知功能障碍。认知功能障碍对于缺血性卒中患者的影响甚至超过肢体功能障碍对脑卒中患者日常生活活动的影响,认知功能障碍影响缺血性脑卒中患者神经功能的全面康复,因此,加强缺血性卒中认知功能障碍的防治研究尤为重要。梓醇为环烯醚萜单糖苷类化合物,主要存在于中药地黄中,具有多种药理作用,如降血糖作用、抗炎作用、抗肿瘤作用、保肝作用、抗老年性痴呆作用、抗脑缺血作用、神经系统保护作用等,其中梓醇抗脑缺血作用和神经系统保护作用明确,受到医学界的广泛关注。梓醇能抑制神经细胞凋亡、抗氧化损伤、抗炎、促进缺血区血管新生、促进脑缺血损伤动物神经修复。本课题组前期研究结果已经证实:梓醇能明显改善脑缺血大鼠神经功能障碍。通过采用大鼠永久性大脑中动脉缺血模型和缺血再灌注模型,梓醇能降低大鼠的神经功能行为学评分,优化受损肢体的运动整合及协调性,增强受损肢体精细运动执行能力和触觉敏感度,促进了神经功能恢复。梓醇能减轻大脑皮层神经元损伤,增加完整神经元数,改善脑组织病理超微结构。其主要作用环节可能与抑制脑缺血损伤的炎症反应,改善能量代谢障碍和氧化应激损伤,抑制神经细胞凋亡作用有关。本研究是在前期研究基础上的继续深入。本研究分为两个部分,第一部分,由于脑缺血可引起认知功能障碍,因此考察梓醇对脑缺血损伤大鼠认知功能障碍的改善情况;脑缺血不仅影响脑灰质,也会影响到脑白质。脑缺血后神经功能的最终恢复不仅依赖于对神经元和灰质的保护也依赖于对白质的保护。脑缺血容易导致脑白质损害,胼胝体属于脑白质的一部分,由于其脑血管解剖上的特点,是脑缺血中白质的易受损区域之一,因此本研究从白质形态学的角度考察梓醇对脑缺血损伤大鼠脑白质（胼胝体）损伤的保护作用;第二部分,由于钾通道是在神经元上表达的主要离子通道。脑缺血时,钾通道功能发生明显改变,引发了一系列级联反应,导致神经元的活性和功能降低,从而引发神经元的损伤。过度的钾离子外流和细胞内钾的大量丢失是造成脑,缺血细胞损伤和凋亡的主要机制。钾通道异常激活和开放和脑缺血神经细胞凋亡、炎症反应、能量代谢、氧化应激等作用有密切的联系,因此梓醇抗脑缺血的药理作用和钾离子通道的关联性分析备受关注,因此本研究探索梓醇抗脑缺血损伤的机制是否和钾离子通道有关以及可能作用的钾通道亚型,分别从计算机分子对接、整体动物实验、体外细胞实验三个方面考察梓醇与钾离子通道蛋白的相互作用,为下一步梓醇抗脑缺血作用靶点的确认提供实验依据。1 梓醇对大鼠脑缺血损伤的保护作用1.1 梓醇对大鼠脑缺血损伤所致认知障碍的改善作用目的:脑缺血可引起认知功能障碍,考察梓醇对大鼠脑缺血损伤所致的认知功能障碍的改善作用。方法:采用双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤动物模型,造模后第30天将大鼠分成模型组、梓醇15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg组,尼麦角林7mg/kg组,连续灌胃给药30天。Morris水迷宫检测学习记忆,HE染色观察大鼠海马CA1区组织形态学,免疫组织化学法检测海马CA1区Bax及Bcl-2蛋白表达,比色法测定海马组织一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）的活性,ELISA法测定海马乙酰胆碱酯酶（AchE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）活性。结果:①Morris水迷宫,模型组大鼠第3天和第4天潜伏期较假手术组明显延长,模型组站台穿越次数是0。与模型组相比,梓醇30mg/kg和60mg/kg大鼠第3天和第4天潜伏期明显缩短。梓醇15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg站台穿越次数明显增加。②HE染色,假手术组海马CA1区可见紧密排列的锥体细胞,神经细胞核仁、核膜清晰,胞浆染色正常;模型组海马CA1区锥体细胞排列紊乱,部分神经元脱失,神经元大小不一,形态改变,呈三角形或不规则形,细胞核缩小、凝聚,呈深蓝,模糊不清,部分细胞皱缩呈细梭形;梓醇各组神经细胞核固缩减少,神经元变性程度减轻,完整锥体细胞数明显增多。③与模型组比较,梓醇30mg/kg和60mg/kg海马CA1区促凋亡蛋白Bax蛋白表达显著减少,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著增加,Bcl-2/Bax 比值显著增加。④与模型组比较,梓醇60mg/kg海马NO含量和NOS活性降低,梓醇30mg/kg海马NO含量降低。⑤与模型组比较,梓醇30mg/kg和60mg/kg海马AchE含量降低。结论:梓醇对大鼠脑缺血损伤所致的认知功能障碍有改善作用,能够提高学习记忆能力,能抑制海马神经细胞凋亡、降低NO含量、抑制NOS活性及改善胆碱能系统。1.2 梓醇对大鼠脑缺血损伤脑白质（胼胝体）的保护作用目的:前期研究已证明梓醇能减轻脑缺血损伤大鼠缺血周围区大脑皮层（灰质）神经元病理及超微结构损害,对神经元有良好的保护作用。脑缺血容易导致脑白质损害,胼胝体属是脑缺血中白质的易受损区域之一,本研究从形态学的角度考察梓醇对大鼠脑缺血脑白质（胼胝体）损伤的保护作用。方法:采用大鼠永久性大脑中动脉缺血模型,大鼠分成模型组、梓醇15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg组、丁苯酞70mg/kg组和依达拉奉7mg/kg组和假手术组,缺血后第3天至第14天给药。采用Longa法对大鼠神经功能进行评分,HE染色和卢卡斯快蓝（Luxol fast blue,LFB）染色观察胼胝体区病理学改变;免疫组织化学检测胼胝体髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）的表达。结果:①在脑缺血后第10天和第14天,梓醇30mg/kg和60mg/kg大鼠神经功能行为学评分明显降低。②HE染色,假手术组可见白质纤维排列整齐,胶质细胞形态正常;模型组可见白质疏松、空泡形成、胶质细胞深染、间质水肿;梓醇组胼胝体少许空泡形成、胶质细胞形态趋于正常。③LFB染色,假手术组胼胝体可看到较深的蓝色。模型组染成蓝色髓鞘颜色变浅,髓鞘变得稀疏,与假手术组比较,模型组积分光密度值明显降低。与模型组比较,梓醇30mg/kg和60mg/kg积分光密度值显著升高。④假手术组髓鞘碱性蛋白（MBP）表达较强,为黄褐色;在模型组表达明显减弱,着色较浅,且分布不均匀。模型组积分光密度值均明显低于假手术组,与模型组比较,梓醇30mg/kg、60mg/kg积分光密度值显著升高。结论:梓醇能降低脑缺血损伤大鼠神经功能评分,改善神经功能缺损症状,梓醇对脑缺血所致的白质损伤有保护作用。2 基于电压依赖性钾通道探讨梓醇抗脑缺血作用机制2.1 梓醇和钾离子通道的分子对接研究目的:采用分子对接方法筛选梓醇与钾离子通道Kir3.2、Kir6.2、K2P10.1、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2、Kv7.1、Kv7.2和Kv11.1结合情况。方法:梓醇与钾离子通道进行分子对接计算。受体的三维结构取自晶体结构数据库（www.rcsb.org）或同源模建得到结构。同源模建采用的是Schr?dinger软件的Prime模块进行构建。在Schr?dinger软件中用protein preparation wizard工具完成加氢、去结晶水、加端基等准备工作,选用OPLS2005力场。然后用Receptor grid generation生成格点对接文件,选定残基或晶体结构原配体作为对接中心,设定盒子大小,生成格点文件。在Schr?dinger软件绘制小分子化合物结构,然后在该软件中用LigPrep进行配体处理,所用力场为OPLS2005,生成PH 7.0±2.0时的可能构象,离子状态处理用Epik方法,保持指定手性,得到用于对接的配体结构。最后用Schr?dinger软件的Glide模块进行受体与配体的对接计算。结果:用同源模建方法分别得到了 Kir6.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2、Kv7.2和Kv11.1的三维结构,将梓醇与上述钾离子通道及已知结构的Kir3.2、K2P10、Kv7.1钾离子通道进行分子对接,结果表明梓醇能够进入十个钾离子通道的活性空腔,其对接得分分别为-4.22,5.41,-5.72,-5.97,-5.70,-4.63,-5.49,-3.96,-6.33,-5.10。结论:根据梓醇与钾离子通道的对接打分和结合模式,并与已知对照药物的对接结果进行比较,推测梓醇与 Kir3.2、Kir6.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2、Kv7.1 和 Kv7.2这八个钾通道亚型结合较好,梓醇和K2P10.1、Kv11.1钾通道亚型结合较差。2.2 梓醇对大鼠脑缺血损伤海马电压依赖性钾通道亚型表达的影响2.2.1 大鼠脑缺血损伤海马电压依赖性钾通道亚型Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1和Kv4.2 mRNA表达变化规律目的:分子对接结果表明梓醇与以上八个钾通道亚型结合较好,查阅国内外大量文献,表明脑缺血后电压依赖性钾通道Kv1.4,Kv1.5,Kv2.1,Kv4.2有明显上调,所以在整体实验,采用脑缺血再灌注损伤动物模型,考察大鼠脑缺血再灌注损伤第1天至第10天四个电压依赖性钾通道Kv1.4,Kv1.5,Kv2.1,Kv4.2mRNA随时间表达的变化规律。方法:采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,q-PCR方法测定脑缺血后第1天、第3天、第5天、第7天、第10天每个时间点大鼠海马组织Kv1.4,Kv1.5,Kv2.1,Kv4.2mRNA的表达,寻找变化规律。结果:和假手术相比,脑缺血再灌注大鼠海马组织Kv1.5 mRNA第1和天第10天表达明显上调;海马组织Kv1.4 mRNA和Kv4.2mRNA表达上调,但各时间点和假手术相比无差异性;和假手术相比,脑缺血再灌注大鼠海马组织Kv2.1mRNA在第1天、第3天、第5天、第7天、第10天表达明显上调。结论:大鼠脑缺血再灌注后海马组织四个电压依赖性钾通道亚型Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2 mRNA表达在不同时间点均有不同程度上调,其中Kv2.1 mRNA的表达在海马有明显上调。2.2.2梓醇对大鼠脑缺血损伤海马电压依赖性钾通道亚型Kv2.1mRNA表达的影响目的:大鼠脑缺血再灌注海马组织Kv2.1 mRNA的表达有明显上调,所以重点考察梓醇对大鼠脑缺血再灌注损伤海马组织Kv2.1 mRNA表达的影响。方法:采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,将造模大鼠分成模型组、梓醇60mg/kg组。q-PCR方法检测大鼠海马脑缺血后第1天、第3天、第7天、第10天每个时间点Kv2.1mRNA的表达。结果:和假手术相比,模型组大鼠在脑缺血再灌注后海马组织在第1天、第3天、第7天、第10天Kv2.1mRNA表达明显上调。和模型组相比,梓醇组大鼠在脑缺血再灌注后,海马组织在第7天和第10天Kv2.1 mRNA表达明显下调。结论:梓醇对大鼠脑缺血损伤有保护作用,梓醇可能通过抑制电压依赖性钾通道Kv2.1的表达发挥抗脑缺血的作用。2.3 梓醇对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用及对电压依赖性钾通道亚型表达的影响目的:在体外细胞模型上,考察梓醇对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用及对电压依赖性钾通道亚型表达的影响。方法:采用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）合并无糖培养基造成PC12细胞氧糖剥夺模型,给予梓醇预处理24小时后,倒置显微镜观察细胞形态;MTT法检测细胞存活率;微量法测定细胞培养液乳酸脱氢酶（LDH）活性;微量法测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量;western blot检测细胞内电压依赖性钾通道Kv1.4、Kv1.5、Kv 2.1、Kv 4.2蛋白的表达。结果:①PC12细胞氧糖剥夺损伤后,细胞体积变小,变成球形,细胞突起减少,部分细胞肿胀;破裂成碎片,梓醇组细胞,细胞损伤程度有所减轻,形态得到一定改善,细胞接近正常状态。②PC12细胞氧糖剥夺损伤后细胞存活率下降,梓醇10μmol/L、100μmol/L能明显对抗氧糖剥夺对PC12细胞的损伤,使细胞存活率明显增加。③PC12细胞氧糖剥夺损伤后培养液中LDH释放增多,细胞内SOD活性显著下降,MDA含量升高、GSH含量降低,梓醇能抗氧化应激,抑制细胞LDH释放,升高细胞内SOD活力,升高细胞内GSH含量,降低细胞内MDA含量。④PC12细胞氧糖剥夺损伤后,细胞内电压依赖性钾通道Kv1.5和Kv2.1蛋白表达明显上调,梓醇能下调氧糖剥夺PC12细胞内Kv1.5和Kv2.1蛋白表达。结论:梓醇对缺糖缺氧PC12有保护作用,能抗氧化应激损伤,其机制可能与下调电压依赖性钾通道Kv1.5和Kv2.1蛋白表达有关。结 论结合前期研究基础和本次论文研究结果充分表明:梓醇抗脑缺血作用明确。梓醇口服给药能明显改善永久性脑缺血大鼠模型和脑缺血再灌注大鼠模型神经功能损伤,提高动物脑缺血损伤后整合缺损和协调能力、躯体感觉及精细运动执行能力以及前肢抓握能力。形态学方面,梓醇可以增加缺血区周围完整神经元数目,减轻神经元损伤,改善脑组织超微结构。与抑制神经细胞凋亡、抗氧化应激损伤、改善能量代谢、促进神经修复和重塑有关。梓醇口服给药对大鼠脑缺血损伤所致的记忆功能障碍的改善作用,能抑制海马神经细胞凋亡、降低NO含量、抑制NOS活性及改善胆碱能系统。梓醇对大鼠脑缺血所致白质损伤有保护作用,使胼胝区域体少许空泡形成、胶质细胞形态趋于正常,改善髓鞘结构紊乱,髓鞘LFB染色和髓鞘碱性蛋白（MBP）表达增多。梓醇与钾离子通道的对接打分和结合模式,判断梓醇与Kir3.2、Kir6.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2、Kv7.1和Kv7.2八个钾通道亚型结合较好,在整体动物实验,梓醇可能下调大鼠脑缺血损伤海马电压依赖性钾通道亚型Kv2.1表达,在体外细胞模型上,梓醇能下调缺糖缺氧PC12电压依赖性钾通道亚型Kv1.5和Kv2.1蛋白表达。因此,梓醇抗脑缺血损伤的作用机制与钾通道有关,可能通过抑制电压依赖性钾通道亚型Kv1.5和Kv2.1有关。有关梓醇对钾离子电流的影响还需在以后研究中进一步探索。本研究的创新点1 缺血性卒中可导致认知功能障碍。缺血性卒中时脑动脉狭窄或闭塞,致使脑组织灌注量减少,神经细胞兴奋性下降,脑代谢率下降,从而导致思维过程缓慢,认知功能下降。本研究首次观察梓醇对大鼠脑缺血损伤所致的认知功能障碍的改善作用。梓醇能抑制海马神经细胞凋亡、降低NO含量、抑制NOS活性及改善胆碱能系统。2 脑缺血时,神经元上的钾通道功能发生明显改变,导致神经元的活性和功能降低,从而引发神经元的损伤。抑制电压依赖性钾通道的过度开放则可能发挥对脑缺血细胞损伤的保护作用。本研究首次发现了梓醇抗脑缺血损伤的作用机制与钾通道有关,可能通过抑制电压依赖性钾通道亚型Kv1.5和Kv2.1有关。