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黑色素瘤是威胁全球健康的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康。目前已有15种抗体药物被FDA批准应用于恶性肿瘤的治疗。但是化疗药物的疗效并不理想，使黑色素瘤面临越来越高的发病率和死亡率。现阶段单一靶点治疗的抗体应用已经有所局限，抗体药物将来的发展方向是多个靶点或者多种手段的联合治疗。 迄今为止，介导杀死癌细胞的大多数双特异性抗体具有用于有效激活T细胞的CD3结合位点。在80年代末发现另一个靶位点是CD28，抗CD28单克隆抗体9.3提供了在T细胞活化中旁路辅助细胞需求的信号。从那时起，已经描述了许多具有CD28结合位点的双特异性抗体，其能够不与TCR/CD3结合而激活T细胞。这种效应可通过T细胞和结合的癌细胞之间的突触间隙的形成来解释，由这些细胞的接近产生。这使得T细胞能够将其毒素释放到该间隙中，这导致间隙中的毒素浓度局部的远高于无向释放的。 被称为r28M的双特异性蛋白质针对黑素瘤相关的蛋白聚糖和T细胞上的人CD28分子。为使该抗体可以在转基因山羊乳腺中获得高效表达，本研究选择了牛β-乳球蛋白的基因组框架与r28M编码序列组合成了一系列新的min基因编码框架。 内含子在r28M内的插入位点会影响基因转录过程中的正确剪切，本研究设计构建了以pcDNA3.0为载体框架的四种双特异性抗体质粒GN2017m、GN2017R、GN2017R4、GN2017用于细胞水平cDNA、蛋白的表达检测。通过RT-PCR及SDS-PAGE检测发现GN2017R4在细胞水平有目的蛋白表达。构建能在乳腺反应器特异表达的质粒pTM-GN2017R4，利用Cre/loxp重组酶系统将pTM-GN2017R4目的基因定位整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内，通过体细胞核移植方法制备抗人黑色素瘤CD28双抗转基因山羊。 将上述pTM-GN2017R4质粒与PBS185质粒共转染人溶菌酶山羊成纤维细胞，利用嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆，通过PCR及测序验证目的基因是否整合到预定位点，最终成功获得了定位整合阳性细胞株，并作为体细胞核移植的供体。选择30头2岁左右健康关中奶山羊作为供体，控制同步发情，最终超数排卵处理后总共获得卵母细胞248个，融合后获得重构胚159株，移植入20头受体母羊内。35天后进行B超妊娠检查，共检查到11头母羊出现孕囊，怀孕率为55％(11/20)。剖腹取出35天大小羊胎儿，经PCR方法和测序鉴定，此胎儿为pTM-GN2017R4转基因羊。本研究利用转基因山羊乳腺生物反应器为大量生产GN2017双特异性抗奠定了坚实的基础。