在生命发育的过程中,中枢神经系统的正常有序的构建是形成高级生命所必须的[1-3]。以小鼠为模型,在胚胎时期,位于大脑皮层内侧侧脑室周围区域的神经干细胞通过不断的增殖,分化,迁移等过程以“inside-to-outside”的方式形成了包含6层不同类型神经元结构的高度复杂的初级大脑结构[4]。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)被定义为能够生成神经组织或者是来源于神经系统中,可以自我更新的多能性干细胞,其在胚胎发育过程中产生多种类型的神经元和神经胶质细胞[5]。一些神经干细胞在成年脊椎动物的大脑中持续存在,在整个生命进程中持续产生新生的神经元[6]。干细胞区别于其他成体细胞的特征在于其分化成多种细胞类型的能力。干细胞经历对称或不对称细胞分裂成两个子细胞。在对称细胞分裂中,两个子细胞也是干细胞。在不对称分裂中,干细胞产生一个干细胞和一个走向分化方向的细胞。在发育的过程中,神经干细胞主要分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。具体而言,在小鼠胚胎发育时期,神经干细胞主要位于皮层区域两个发生区域,侧脑室区域(Ventricular zone,VZ)和侧脑室下区域(Subventricular zone, SVZ),而且处于不同位置的神经干细胞的种类是不一样的[7]。在侧脑室区域的放射状胶质细胞(Radial glial cells, RGs)通过对称分裂完成神经干细胞的自我更新,形成新的子代RGs,或者通过不对称分裂形成神经系统的中间祖细胞(Intermediate Progenitor cells,IPs)细胞:位于侧脑室下区域的IPs细胞通过对称分裂形成神经元,这些神经元沿着RG细胞的放射状突起不断地向上迁移成熟到达特定的区域形成完整的大脑皮层[8]。在这一系列的变化过程中,不同的转录因子按照时间和空间的先后顺序不断地激活(Pax6-Tbr2-Tbr 1 -Cux 1 -Satb2),精确地调控神经干细胞的命运[9,10]。大脑皮层构建过程中的任何一个步骤发生问题都会导致严重的发育疾病,比如精神分裂症[11],自闭症[12]等。但是,目前我们对于神经干细胞增殖,分化,迁移的深入机制还不十分清楚,需要进一步地探究。在胚胎大脑皮层发育的过程中,各种形式的表观遗传调控发挥着重要的功能,比如组蛋白的甲基化[13],乙酰化[14],磷酸化[15]; DNA的甲基化[16];microRNA等等。在这些表观遗传修饰中,组蛋白变异体是一个很大的家族,包含H2A.Z,H2A.X, macroH2A,H3.3[17-19]等。在我们实验体系中,我们重点关注了 H3.3这种非常关键的组蛋白变异体[20]对神经发生过程的影响。真核生物的核小体由不同种类的组蛋白构成,包含H1,H2A,H2B, H3和H4[21]。在基因转录激活或是抑制的过程中核小体中的组蛋白构成会发生变化,比如在转录活化时,H2A.Z和H3.3会替换到核小体内,形成一种染色体活化的标志物,影响蛋白和DNA在染色质水平的可接近性,从而促进转录的进行[22]。组蛋白变异体在基因组中的特定区域发挥对基因的表达的调控功能[23,24]。对这些复杂的有组蛋白变异体参与的转录调控的研究有助于我们更深入了解基因的表达过程。同时,将对组蛋白变异体的探索引入到胚胎早期神经干细胞相关的研究中,可以帮助我们从一个新的角度揭示它们在发育过程中的重要作用。以往的研究表明H3.3可以通过替换H3来调控基因的转录[25],这时染色体处于一种转录活性状态。H3.3上包含丰富的表观遗传修饰位点,可以发生不同的表观遗传修饰,进一步调控不同生命发育过程[26]。在我们的研究结果表明H3.3在胚胎早期神经干细胞中有表达:在体内和体外,H3.3都会和神经干细胞的标志物共标,而且H3.3的表达在时间和位置上有一定的特异性。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,H3.3敲降后会导致神经干细胞增殖的比例减少,分化的神经元的比例增加。通过进一步的探索,我们发现H3.3的减少会导致另一种组蛋白修饰H4K16ac的减少,而这是因为H3.3表达量的降低会减少其对H4K16位点特异性乙酰化转移酶的招募,从而降低了 H4K16ac的水平并且影响了基因的转录活化。这提示我们在神经干细胞发育的过程中H3.3和H4K16ac这两种组蛋白密码相互协同,调控神经干细胞的命运。通过转录组测序,我们发现在H3.3敲降影响了大量神经发生相关的生物过程。进一步分析数据后我们发现,GLI(GLI-Kruppel)家族的所有基因都是降低的,而其中GLI1减少的最多。通过进一步的Western和小鼠体内胚胎电转的实验证明GLI1是H3.3的下游基因,其在神经干细胞增殖分化的过程中发挥重要的功能。在大脑皮层发育的过程中谷氨酸是一种必不可少的氨基酸[27],发挥着重要的生物学功能[28]。在哺乳动物体内,谷氨酸的受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体[29]。代谢型谷氨酸受体被报道与神经疾病相关,是一些神经疾病的靶点,可以调控神经递质的释放和神经元的兴奋性[30]。不同的代谢型的谷氨酸受体主要因为其蛋白序列,功能,配体的不同被区分为3类。其中包括 Ⅰ (GRM1 and GRM5),Ⅱ(GRM2 and GRM3),和 Ⅲ (GRM4,GRM6,GRM7, and GRM8)。在分析了以往的报道后,我们发现代谢型谷氨酸受体7(GRM7)作为一种仅在神经元突触前膜上特异性表达的G蛋白偶联受体,在接收到谷氨酸的刺激时会产生抑制性的作用。而且有报道称GRM7可能与新生儿自闭症(Autism Spectrum,ASD )和注意力缺陷(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)相关。但是GRM7是否会影响胚胎时期大脑皮层的发育还是未知的。在我们的实验中,我们通过在胎鼠大脑皮层内过表达和敲降GRM7的方法来研究GRM7在神经干细胞发育过程中的重要作用。结果发现,GRM7在神经干细胞中有表达:在体内或体外的染色结果都表明GRM7和神经干细胞的标志物共标,而且GRM7在不同发育时期的表达是动态的。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,GRM7敲降会导致神经干细胞增殖的比例增加,而神经元分化的比例减少,而且神经元的形态发育也会受到影响。在机制上的研究表明,在GRM7 的表达受到影响后会改变 CREB (cAMP Responsive Element Binding Protein)蛋白的磷酸化水平,而p-CREB作为一种转录调控因子会影响下游基因的表达。后续的实验证明YAP (Yes Associated Protein)作为GRM7和p-CREB的下游发挥调控神经干细胞增殖和分化的功能。