大量研究报道表明肿瘤坏死因子在肝损伤疾病中起着重要作用,本实验室前期的研究也提示了肿瘤坏死因子在鸭肝炎的发病过程中起着重要的作用,但到目前为止还未见鸭肿瘤坏死因子克隆表达的相关报道,本研究通过分子生物学方法克隆表达了鸭肿瘤坏死因子,并利用制备的抗鸭TNF-α多克隆抗体建立鸭肝脏TNF-α免疫组织化学检测方法,从而为今后进一步研究其生物学活性、结构功能、开发检测试剂盒及其在鸭肝炎发病机制中作用研究提供帮助和支持。本文主要完成了以下研究工作:1.鸭TNF-α基因的克隆与表达根据GenBank中收录的鸡TNF-αcDNA序列设计合成了克隆引物,然后提取鸭脾脏总RNA,利用RT-PCR方法扩增到TNF-α基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,构建了基因的原核表达质粒(pET-32a-TNF-α),并在E.coli BL21(DE3)中成功获得了表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,出现了分子量大小为36KD的蛋白条带,与预期融合蛋白的分子量大小一致。而且Western-blotting分析表明表达产物pET-32a-TNF-α融合蛋白具有良好的生物学活性,为今后的研究奠定了坚实的基础。2.兔抗鸭TNF-α多克隆抗体的制备将纯化的重组蛋白pET-32a-TNF-α作为免疫原,通过设计好的免疫程序,成功制备了兔抗重组蛋白pET-32a-TNF-α的高免血清,间接ELISA方法测得血清效价为1:51200。3.鸭TNF-α蛋白免疫组织化学方法的建立利用制备的兔抗鸭TNF-α多克隆抗体,建立了鸭TNF-α蛋白的免疫组织化学检测方法,并对鸭肝脏组织TNF-α蛋白进行了定位,结果显示阳性信号主要位于窦内皮细胞的细胞质内。