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研究背景目前认为,心肌纤维化是高血压左室肥厚的重要表现之一,其发病机制还不十分清楚。近来有研究发现,在高血压大鼠心肌中观察到炎性细胞和成纤维细胞并存于纤维化区域,说明炎症参与了其病理过程。文献报道,在心肌纤维化过程中炎性细胞尤其是单核细胞浸润是关键问题,其中趋化因子起重要作用。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是CC型趋化蛋白的一种,对单核细胞有特异性趋化作用,提示在压力负荷大鼠心肌MCP-1的表达可能是心肌纤维化的机制之一。近来研究表明,活性氧(reactive oxygen species, ROS)可以调节心肌细胞生长、诱导细胞凋亡、激活多种信号蛋白及调控细胞外基质代谢,在心室肥厚和心衰中发挥重要作用。但是,在压力负荷下ROS是否参与心肌纤维化,与MCP-1的表达有何关系目前尚不十分清楚。ROS可以激活多种氧化还原敏感的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)超家族成员,包括P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2等,但ROS具体通过哪条信号通路诱导MCP-1表达目前尚无报道。他汀类药物是3-羟-3-甲戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA,HMG-COA)还原酶抑制剂,近年研究发现他汀类药物有抗氧化、抗炎、抗纤维化等作用。但是它对压力负荷大鼠ROS和MCP-1的作用如何目前也不十分清楚。研究目的本课题观察压力负荷大鼠氧化应激水平和MCP-1表达的变化及其相关性;初步探讨P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2信号途经在其中所起的作用;同时研究辛伐他汀抗炎、抗氧化的可能机制,旨在阐明氧化应激和炎症在高血压心肌纤维化中的作用,为防治高血压和心肌纤维化提供新的理论依据和治疗思路。研究方法与内容本研究以腹主动脉缩窄(abdominal aortic coarctation ,AC)大鼠为实验模型,采用分光光度计、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印记(Western blot)、免疫组化、计算机图象分析等技术,动态观察:(1)AC对心肌纤维化的影响;(2)AC对大鼠心肌ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)等氧化应激指标的影响;(3)AC对大鼠心肌MCP-1mRNA和蛋白表达及巨噬细胞浸润的影响;(4)N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)阻断对氧化应激指标和MCP-1表达的影响;(5)P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2信号分子在ROS诱导MCP-1表达中的作用;(6)辛伐他汀对ROS和MCP-1表达的影响,及其对心肌重构的逆转作用。研究结果(1)AC术后1～4周均显著升高大鼠平均动脉压(P<0.05);AC术后2～4周显著增加左室质量分数(LVW/BW)(P<0.05),但AC术后1周LVW/BW与假手术组(sham)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2) AC引起心肌间质纤维化和血管周围的纤维化。AC术后2～4周的胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF),分别为3.28%±0.22%,5.38%±0.17%,7.09%±0.33%,各组与sham组(0.87%±0.19%)比较,均有非常显著性差异(P<0.01);1周组CVF为1.06%±0.17%,与sham组比较,差异不显著(P>0.05)。AC术后2～4周组的血管周围胶原面积(perivascular collagen area,PVCA)分别为15.03%±0.88%,20.12%±1.01%,24.99%±0.91%,各组与sham组(6.19%±0.41%)比较,均有非常显著性差异(P<0.01),1周组PVCA为9.02%±0.6%,与sham组比较,无显著性差异(P>0.05)。(3)ROS在AC术后1周明显增加(30.43±1.50 U/mg pro),2周达到高峰(42.27±1.33 U/mg pro),3、4周稍有回落(34.91±1.60、32.33±1.36 U/mg pro),但与sham组(17.29±1.78 U/mg pro)比较仍显著增高(P<0.01)。NAC 1～4周组心肌ROS含量分别为12.12±0.75、11.76±0.67、12.08±0.78、14.0±0.7 U/mg pro,与AC组各对应时间点比较,差异非常显著(P<0.01)。(4) AC术后1～4周心肌SOD表达量分别为261.19±6.69、185.86±3.59、192.93±5.44、217.37±3.10 U/mg pro, NAC 1～4周组SOD分别为369.92±8.04、342.80±7.32、352.48±9.95、358.19±7.07 U/mg pro。AC组较sham组各对应时间点均非常显著升高;NAC组较AC组各对应时间点均非常显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(5) AC术后1～4周心肌MDA表达量分别为3.90±0.19、4.26±0.30、4.12±0.15、4.07±0.18 nmol/mg pro,NAC干预1～4周组分别为1.79±0.20、1.93±0.11、1.88±0.18、1.80±0.16 nmol/mg pro。AC组均较sham组各对应时间点非常显著升高;NAC组均较AC组各对应时间点非常显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(6) AC术后1～4周心肌CAT表达量分别为7.36±0.86、5.80±0.91、6.49±0.63、6.70±0.78 U/mg pro,NAC组1～4周分别为13.42±1.12、11.06±1.24、11.83±0.67、12.22±0.90 U/mg pro。AC组较sham组各对应时间点非常显著降低;NAC组较AC组各对应时间点非常显著升高(P<0.01)。(7) AC术后ED1阳性细胞数1周开始增加(246±24),2周达到高峰(582±33),3、4周稍下降(512±30,386±26),与sham组各对应时间点比较,差异均非常显著(P<0.01)。NAC1～4周组ED1阳性细胞数分别为95±9、144±39、126±15、106±26,与AC组各对应时间点比较,差异均非常显著(P<0.01)。(8) AC术后1～4周心肌组织MCP-1蛋白水平表达量分别为66.95±4.53、84.79±5.92、43.10±3.11、36.23±3.18 pg/mg pro,各组与sham组各对应时间点相比,均有非常显著性差异(P<0.01)。NAC 1～4周组MCP-1蛋白表达量分别为21.34±3.02、33.73±2.38、22.3±2.76、19.35±2.82 pg/mg pro,与AC组各对应时间点比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(9) AC术后1～4周MCP-1 mRNA水平分别为0.83±0.08、0.57±0.07、0.45±0.06、0.3±0.07,各组与sham组各对应时间点比较,均有非常显著性差异(P<0.01)。NAC组1～4周MCP-1 mRNA水平分别为0.34±0.08、0.26±0.04、0.22±0.04、0.21±0.04,各组与AC组各对应时间点比较,差异非常显著(P<0.01)。(10)AC组大鼠心肌P38-MAPK的磷酸化水平较sham组无明显增加(P>0.05), NAC干预后心肌P38-MAPK的磷酸化水平,与AC组比较也无显著差别(P>0.05)。(11)AC组大鼠心肌ERK1/2磷酸化水平明显增高,ERK1/2活性较假手术组增加53%(P<0.01),NAC干预后ERK的磷酸化水平无明显降低(150%±10% vs 153%±11%),无统计学意义(P>0.05)。(12)AC组大鼠心肌JNK1/2磷酸化水平明显增高,JNK1/2活性较假手术组增加40%(P<0.01),NAC干预后JNK1/2的磷酸化水平显著降低,(140%±10% vs 117%±11%),差异有统计学意义(P<0.01)。(13)AC组大鼠平均动脉压(179.00±6.78 mmHg)较sham组(95.83±5.30 mmHg )显著增高(P<0.05),辛伐他汀组(176.33±5.74 mmHg )较AC组略有降低,但无统计学意义(P>0.05);AC组大鼠LVW/BW(3.27±0.04 mg/g)明显较sham组(2.24±0.05 mg/g )增高(P<0.05),辛伐他汀组(2.74±0.07 mg/g)较AC组显著降低(P<0.01)。(14)AC组大鼠CVF和PVCA分别为7.09%±0.33%、24.99%±0.91%,与sham组(0.87%±0.19%、6.19%±0.41%)比较,差异非常显著(P<0.01),辛伐他汀组(4.32%±0.23%、16.42%±0.58%)与AC组比较,也有非常显著性差异(P<0.01)。(15)AC组大鼠ROS(32.33±1.36 U/mg pro)较sham组(17.44±1.92 U/mg pro)显著升高(P<0.01),辛伐他汀组(13.96±0.74 U/mg pro)较AC组显著降低(P<0.01)。(16)AC组大鼠巨噬细胞阳性数(386±26)较sham组(39±11)显著升高(P<0.01),辛伐他汀组(196±16)较AC组显著降低(P<0.01)。(17)AC组大鼠MCP-1蛋白(36.23±3.18 pg/mg pro)明显较sham组(13.34±1.88 pg/mg pro)升高(P<0.01),辛伐他汀组(23.68±2.64 pg/mg pro)明显较AC组降低(P<0.01)。(18) RT-PCR检测各组大鼠MCP-1mRNA表达, sham组、AC组、辛伐他汀组分别为0.18±0.05,0.3±0.07,0.21±0.04,AC组非常显著高于sham组(P<0.01),辛伐他汀组较AC组非常显著降低,并有统计学意义(P<0.01)。研究结论(1)AC可造成大鼠高血压心肌纤维化的模型。(2)AC大鼠心肌ROS、MDA表达上调,抗氧化酶SOD、CAT表达下调,参与心肌纤维化发生、发展。(3)AC大鼠心肌MCP-1mRNA和蛋白表达量上调,提示两者与心肌纤维化有关。(4)NAC干预后,可以显著减轻氧化应激水平和MCP-1mRNA及蛋白表达,说明MCP-1的表达是ROS介导的。(5)JNK1/2和ERK1/2参与了高血压心肌纤维化,但ROS可上调大鼠心肌JNK1/2水平,但不影响P38-MAPK和ERK1/2的表达。(6)辛伐他汀可能通过抗氧化应激和下调MCP-1表达,来改善心肌纤维化,达到逆转心室重构的目的。综上所述,压力负荷大鼠心肌氧化应激和炎症参与了心肌纤维化的发生发展。ROS介导MCP-1表达可能是通过MAPK信号通路中的JNK1/2起作用;辛伐他汀可以通过抑制ROS和MCP-1的表达来发挥逆转心肌纤维化的作用。