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第一部分:骨靶向多肽的体外细胞实验研究目的:通过体外细胞实验评价骨靶向多肽的成骨活性方法:采用ALP活性检测及染色、RT-PCR、Western Blot检测骨靶向多肽促进MC3T3-E1成骨分化能力。结果:1.骨靶向多肽能显著提高MC3T3-E1细胞的ALP活性(P<0.05)。2.骨靶向多肽能显著上调MC3T3-E1细胞ALP、COL-1、RUNX2 m RNA表达量(P<0.05)。3.骨靶向多肽能显著上调MC3T3-E1细胞ALP、COL-1、RUNX2蛋白表达量(P<0.05)。结论:骨靶向多肽具有较好的成骨活性。第二部分:骨靶向多肽/煅烧骨支架的制备和评价目的:研究煅烧骨(TBC)支架的理化性质并构建骨靶向多肽/TBC支架,评估骨靶向多肽与TBC在体外的亲和性,以及骨靶向多肽/TBC支架中骨靶向多肽的缓释性能。方法:1.制备煅烧牛松质骨,60Co辐照灭菌,通过X射线光电子能谱(XRD)、傅立叶红外光谱仪(FTIR)、扫描电镜(SEM)对其进行表征,分析物相和形貌以及微孔孔径大小、孔隙率。2.将TBC支架材料(0.5 cm×0.5 cm×0.5cm)为吸附的主要介质,将其与100ug/ml多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2溶液充分作用10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min,BCA(Bicinchonininc acid assay)法测定上清液中多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2的浓度,绘制吸附曲线。3.以TBC支架材料(0.5 cm×0.5 cm×0.5cm)为吸附的主要介质,将其与100ug/ml具有荧光标记的多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2溶液充分作用120min后,取出后避光于冷冻干燥机中,12小时后取出在荧光显微镜下进行观察。4.将0.5 cm×0.5 cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料分别置于无菌冻存管中,加入2ml无菌PBS溶液,置于37℃恒温摇床上持续振摇。分别在振摇1d,2d,3d,4d,5d,6d,7d,8d,9d,10d,12d,14d,17d,21d,28d后检测释放液中骨靶向多肽、多肽和rh BMP2含量,计算均值并绘制累计释放曲线。结果:1.TBC主要成分为HA,表面孔隙大小主要分布在220~650μm之间,孔隙率为84.4±0.3%,力学强度检测,其极限载荷为65N,极限压强为2.6Mpa。2.荧光显微镜下观察发现骨靶向多肽在TBC表面吸附较多,显著高于多肽和rh BMP-2组。吸附曲线提示:多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2在30min内均能快速地与TBC进行吸附,其中多肽和rh BMP-2达到吸收的峰值。靶向多肽随着时间仍呈现升高趋势,在120min时达到顶峰。3.缓释曲线提示:与多肽与rh BMP-2相比,骨靶向多肽复合TBC后的释放时间延长。结论:高温煅烧的TBC支架保留了天然骨的基本理化特性,具有良好的骨传导性;骨靶向多肽与TBC支架亲和性较强,骨靶向多肽复合TBC后的释放具有缓释效果。第三部分:骨靶向多肽/TBC支架生物相容性和骨诱导活性研究目的:研究骨靶向多肽/TBC支架的生物相容性,评估骨靶向多肽/TBC支架的安全性和骨诱导活性,为其体内应用提供依据。方法:1.骨靶向多肽/TBC与无血清培养基比例为0.2g/ml,密封混合于37°C恒温箱中,浸提24小时后制备浸提液,使用100%、75%、50%、25%的浸提液、培养基(阴性对照组)和0.64%苯酚溶液(阳性对照组)与L929细胞共培养24小时、48小时和72小时后观察细胞生长和细胞相对增值率。2.取成年SD大鼠20只,雌雄各半,随机分为实验組和假手术组,每组各10只,麻醉成功后将0.5cm×0.5cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC支架植入皮下组织,术后观察大鼠一般情况,术后将支架及其周围组织完整取出,行HE染色观察。3.将MC3T3-E1细胞以1×105/ml浓度均匀接种于靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料表面,培养5天后通过SEM观察细胞生长情况,并利用MTT法测定支架表面细胞的ALP活性。4.取SPF级昆明小鼠8只,雌雄各半,随机分为骨靶向多肽/TBC组、多肽/TBC组、rh BMP-2/TBC组、TBC组,每组各2只,麻醉成功后,分别将支架材料植入小鼠股四头肌肌间隙中,术后观察一般情况,4周时取材,HE染色观察支架材料周围的新骨形成情况。结果:1.细胞毒性实验结果提示:各浸提液组中的L929细胞均生长良好,无细胞毒性,细胞相对增值率与阴性对照组相比无统计学差异,细胞毒性分级为I级。2.骨靶向多肽/TBC支架植入大鼠皮下12周后的亚慢性毒性试验结果显示:实验组与对照组在大体观察上未发现差异,HE染色也未见炎性细胞浸润和坏死。3.SEM观察发现,MC3T3-E1细胞在骨靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料表面生长较好,细胞呈长梭形和多角形,细胞数量较多,连接成片,ALP活性也明显高于多肽/TBC支架材料组和TBC组。4.HE染色提示:TBC组中,在材料周围主要是纤维结缔组织;在骨靶向多肽/TBC支架材料组中,材料中间有大量的新骨形成;在rh BMP-2/TBC支架材料组中,在材料与肌肉接触的边缘可见较多的新骨形成。结论:骨靶向多肽/TBC支架材料无细胞毒性,细胞在其表面生长良好,具有良好的生物相容性,在肌间隙内具有良好的骨诱导活性。第四部分:骨靶向多肽/TBC支架修复大鼠颅骨缺损研究目的:探讨大鼠颅骨缺损模型建立的相关影响因素,研究骨靶向多肽/TBC支架材料修复颅骨缺损的可行性和疗效。方法:1.游标卡尺测量大鼠颅骨双侧顶骨的前后径和横径。2.取成年雄性SD大鼠50只,随机分为5mm缺损组(40只)和8mm缺损组(10只),其中5mm缺损组根据是否屏蔽硬脑膜和骨膜,随机分为四组:硬脑膜屏蔽组、骨膜屏蔽组、硬脑膜和骨膜均屏蔽组、未处理组。术后8周和12周取材,通过影像学和组织学对其骨修复能力进行评价。3.在大鼠颅骨缺损模型中,将骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC、TBC支架材料分别植入缺损处,术后4周和8周取材,行影像学和组织学观察。结果:1.大鼠颅骨顶骨前后径为7.44±0.42mm;左右径为5.13±0.12mm。2.大鼠颅骨缺损(双侧,CSD为5mm)在术后8周和12周Micro-CT检测提示:硬脑膜和骨膜均屏蔽组中,新生骨形成最少,体积百分比(BV/TV×100%)在分别为10.6±3.4%,17.4±5.7%;在未处理组中,缺损修复较好,新骨形成体积百分比为61.6±7.4%,90.6±4.1%。HE染色观察发现,在硬脑膜和骨膜均屏蔽组中,缺损处有大量的纤维结缔组织,骨长入较少;而未处理组中大量新生骨组织生成。3.大鼠颅骨缺损模型中,双侧5mm和8mm(中央侧)在硬脑膜和骨膜均屏蔽时,术后8周和12周新生骨形成百分比相比无统计学差异,在术中出血量、手术时间和死亡率方面,8mm组显著高于5mm组。4.术后4周和8周Micro-CT检测提示:rh BMP-2/TBC组和骨靶向多肽/TBC中新生骨体积百分比无显著差异,均高于多肽/TBC组,而TBC组中的新生骨体积百分比最少。5.术后4周和8周HE染色观察发现,TBC组中骨组织长入较少,在多肽/TBC、骨靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC组中,骨组织长入较多,其中靶向多肽/TBC组中在材料周围和缺损边缘可见大量的新生骨组织。6.术后免疫组化染色:4周时TBC组成骨相关蛋白的表达最弱,多肽组、骨靶向多肽组、rh BMP-2组成骨相关蛋白表达依次增强;8周时,TBC组ALP表达增强,而多肽组、骨靶向多肽组及rh BMP-2组均有不同程度降低;各组OCN表达均增强,其中骨靶向多肽组与rh BMP-2组OCN表达最高。结论:大鼠颅骨缺损模型中,当硬脑膜和骨膜均屏蔽时,双侧5mm缺损在自我修复能力方面与8mm无明显差异,而且并发症较少,适合作为一个骨缺损模型。骨靶向多肽/TBC可以促进大鼠颅骨缺损的修复,是一种较理想的皮质骨缺损修复支架材料。第五部分:骨靶向多肽/TBC支架修复兔股骨髁骨缺损研究目的:探讨骨靶向多肽/TBC支架修复兔股骨髁骨缺损研究的可行性与疗效。方法:取成年雄性新西兰大白兔20只,麻醉成功后,在兔股骨髁外侧利用环钻钻取直径6mm、高10mm的松质骨骨缺损模型,随机分别植入TBC、骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料,每组10只。术后观察动物一般情况,4周和8周时取出,将双侧股骨髁完整取出,行影像学检查和组织学观察。结果:1.术后4周和8周Micro-CT扫描提示:rh BMP-2/TBC组和骨靶向多肽/TBC中新生骨体积百分比无显著差异,均高于多肽/TBC组,而TBC组中的新生骨体积百分比最少。2.HE染色观察发现,TBC中支架材料周围可见少量骨组织长入,在骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC中,骨组织长入较多。在靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC组中,材料周围可见少量板状骨和血管长入,在材料与宿主交界处可见大量新生骨组织。Lane-Sandhu评分中,rh BMP-2/TBC组与靶向多肽/TBC组无明显差异,显著高于多肽/TBC组,TBC组评分最低。Masson染色发现,术后4周,TBC组出现少量胶原纤维,未见新生骨出现;多肽组出现较多胶原纤维,并有少量新生骨生成;骨靶向多肽组中新生骨组织较多。术后8周,各组中新生骨组织均有不同程度增加,其中骨靶向多肽组中可见大量新生骨组织。结论:骨靶向多肽/TBC可以促进兔股骨髁松质骨缺损的修复,是一种理想的松质骨骨缺损修复材料,