目的:利用慢病毒转染人成纤维细胞来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells iPSCs)分化得到的间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)作为种子细胞在体外联合微孔化脱细胞真皮基质(micropore acellular dermal matrix MADM)构建人工复合皮,移植于SD大鼠全层损伤皮肤模型创面,观察和分析此种复合皮的创面修复能力,以验证新型种子细胞iPSCs源性MSC在创面修复过程中的效果。方法:1、复苏人成纤维细胞来源的iPSC-MSCs,传代培养记录细胞生长曲线,并通过成脂诱导分化和成骨诱导分化实验简单验证细胞的多能性。分离大鼠背部皮肤经酶消化法联合去污剂法制备ADM,激光打孔后获得MADM。将种子细胞MSCs接种于ADM制备人工复合皮,通过DAPI染液染色标记细胞,镜下计数并观察细胞生长情况,酶标仪检测450mm波长处OD值判断ADM的细胞毒性。2、取12只SD大鼠实验前喂养数天,常规腹腔麻醉,于背部正中部位做U形皮瓣切口,皮瓣边长2厘米,完整去除全层皮肤,分离皮下筋膜,灼热铁丝止血并烫伤创周表皮。将12只SD大鼠随机分成2组:A组MSCs+MADM复合皮组、B组单纯MADM组。将MSCs+MADM复合皮、单纯MADM分别移植于对应组创面上,凡士林油纱覆盖,打包法缝合固定后分笼饲养。分别于植入后第1周、第2周、第3周和第4周肉眼观察创面外观及移植皮片周缘的组织生长状况,并经过组织学HE染色鉴定镜下组织生长。荧光显微镜下观察实验组复合皮细胞的存活情况。记录各组各只大鼠创面完全恢复时间,进行统计学分析。结果:1、实验动物数量分析:实验纳入SD大鼠12只,分为2组,进行结果分析的大鼠12只,实验中无脱失。2、iPSC-MSCs的体外培养及传代:复苏第8代细胞接种后呈圆形,24小时后大部分细胞贴壁,贴壁生长细胞逐渐呈现梭型及类圆形,6-8天后细胞多呈长梭型,成纤维细胞样、漩涡状生长。培养周期为10-12天。成脂分化诱导并经油红O染色后可见大而圆的脂滴,成骨诱导分化并经茜素红染色可见钙沉淀。表明iPSC-MSC与其他类型MSCs具有十分相似的生长特点,细胞活性和多能性良好,分化潜能巨大。酶标仪OD值检测显示联合培养细胞与单纯培养细胞差异不明显,说明制备的MADM性能良好,无细胞毒性,可用于复合皮制备及动物实验。3、创面大体观察:A组人工复合皮移植组平均愈合时间为17.33天,镜下见人工复合皮周围大量新生网状血管包绕,颜色红润,触之质地较柔软,与皮下组织融合紧密,边界模糊。B组单纯MADM移植组创面平均愈合时间为21.83天,移植皮片周围新生血管较多,但明显少于实验组A组,且皮片与皮下组织融合状况一般,边界较清楚。统计学分析两组愈合时间,差异有显著性意义(P<0.05)。表明新型种子细胞制备的人工复合皮能够更好地促进创面修复。4、组织学HE染色检查及荧光显微镜下观察:移植初期,实验组A组与对照组B组移植皮片周围均出现轻度炎症反应表现,HE染色示炎性细胞浸润,两组相差不大。移植后第2周观察显示:实验组A组血管网状结构明显多于对照组B组,A组皮下有乳头状结构突入复合皮内,与复合皮融合交错,且出现少许脂肪样组织;对照组B组周围也存在少许环形新生血管结构,皮片与皮下组织分界明显。荧光显微镜下可见移植第一周镜下蓝色荧光点较多,随着时间推移荧光逐渐暗淡,荧光点减少至消失,考虑细胞正常的代谢凋亡所致。结论:新型种子细胞iPSC-MSCs培养条件与常见MSCs相似,具有较高的分化潜能。人工制备MADM细胞毒性不明显,是较好的复合皮支架材料的选择。利用新型种子细胞iPSC-MSCs细胞联合MADM制备人工复合皮能够较好的加快创面修复进程,增加缺损组织填充,有希望成为一种广泛应用的种子细胞。