【摘 要】
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错配修复系统对于维持基因组的完整性具有重要的作用。该系统通过参与细胞周期的调控,产生不同时期的阻滞来为机体修复争取时间,当在阻滞时间内未能完成修复任务又会介导细胞凋亡。肿瘤的形成与错配修复系统缺陷息息相关,目前在多种肿瘤中均已发现存在错配修复基因突变和微卫星异常,但关于鸡错配修复基因以及在肿瘤发生过程中的作用的研究鲜有报道。本课题克隆了鸡错配修复相关基因MLH1并进行了原核表达和抗体的制备,然后沉
【基金项目】
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江苏省自然科学基金（BK20130686）；
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错配修复系统对于维持基因组的完整性具有重要的作用。该系统通过参与细胞周期的调控,产生不同时期的阻滞来为机体修复争取时间,当在阻滞时间内未能完成修复任务又会介导细胞凋亡。肿瘤的形成与错配修复系统缺陷息息相关,目前在多种肿瘤中均已发现存在错配修复基因突变和微卫星异常,但关于鸡错配修复基因以及在肿瘤发生过程中的作用的研究鲜有报道。本课题克隆了鸡错配修复相关基因MLH1并进行了原核表达和抗体的制备,然后沉默DF-1细胞中MLH1基因的表达,通过诱导DF-1细胞DNA损伤研究鸡错配修复相关基因MLH1的功能,为揭示鸡错配修复系统在肿瘤发生过程中的作用奠定了理论基础。本研究通过设计MLH1基因保守区内的引物、提取SPF鸡胚中组织RNA来克隆MLH1基因,与人类的MLH1基因进行比对,然后构建pET 32a-MLH1原核表达载体,转染感受态细胞后使用IPTG诱导获得MLH1重组蛋白,采用镍柱吸附法纯化得到MLH1蛋白并以此为抗原免疫新西兰大白兔。结果显示:MLH1基因全长为2382 bp（KX602287）,编码757个氨基酸,鸡MLH1基因氨基酸序列全长与人MLH1基因氨基酸序列同源性达79.5%。类似组氨酸激酶的ATPases结构域中的ATP结合位点与人的同源性为80%,可能具有与人MLH1基因相似的功能。纯化重组蛋白后免疫得到多克隆兔抗血清。ELISA方法测定多抗效价高于1:20 000,Western blot可检测到血清与重组MLH1蛋白特异性结合的条带。本研究结果为后期研究其在错配修复功能中发挥的作用提供分子与抗体基础。通过基因序列分析,设计沉默质粒psi-U6-MLH1 shRNA1、psi-U6-MLH1 shRNA2、psi-U6-MLH1 shRNA3、psi-U6-MLH1 shRNA4 与对照质粒 NC shRNA,转染DF-1细胞建立MLH1基因沉默细胞模型,使用荧光倒置显微镜观察指示转染的绿色荧光蛋白的表达情况,利用CCK8法检测DF-1细胞的增殖能力,qRT-PCR技术检测MLH1 mRNA转录水平,利用流式细胞术分析细胞周期与凋亡变化情况。结果显示:qRT-PCR技术检测MLH1 mRNA转录水平在转染48h后为沉默效果最佳时间点,mRNA转录被有效抑制,psi-U6-MLH1 shRNA4和psi-U6-MLH1 shRNA 3 对 MLH1 基因有明显抑制作用（2-ΔΔCT:0.25±0.01 和2-ΔΔCT:0.53±0.05）:荧光倒置显微镜观察指示转染的绿色荧光蛋白高表达,沉默MLH1后DF-1细胞的增殖能力受到轻微抑制,细胞周期被阻滞在G0/G1期,细胞发生凋亡。通过紫外线辐射或顺铂药物诱导建立细胞损伤模型,应用CCK8法、qRT-PCR技术、流式细胞术等分析DNA损伤对DF-1细胞的影响。结果显示:顺铂诱导对MLH1基因mRNA转录水平影响不显著,细胞增殖能力变化不明显;紫外线辐射诱导的DNA损伤使DF-1细胞MLH1基因mRNA转录水平变化显著升高（P<0.05）,细胞增殖能力抑制显著（P<0.05）,细胞周期会出现G2期阻滞现象,细胞凋亡的情况变化不明显;沉默MLH1基因后再进行紫外线辐射诱导对DF-1细胞MLH1基因mRNA转录水平增高的同时会加重细胞周期的G1期阻滞,加剧细胞凋亡。综上所述,我们对鸡错配修复相关基因MLH1的功能有了初步了解,当MLH1表达量降低时,会导致细胞阻止在G0/G1期,细胞发生凋亡;DNA损伤后,MLH1基因参与DF-1细胞周期调节过程,通过调节细胞产生G1期阻滞影响的修复环节。
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