组氨酸激酶(Histidine kinases,HK)是一种跨膜转移酶类蛋白质,在信号转导过程中可作为信号分子的细胞受体。原核生物中的HKs一般由ATP结合区(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase)及二聚化组氨酸磷酸转移结构域(histidine kinase domain,HisKA)两个保守的结构域组成,真核生物中HKs除了HATPase和HisKA区域外,还具有信号接收区域(receiver domain,RD/REC)来接收并传递信号。在信号传递过程中,HKs感受器感受外界环境的变化后,ATP作为磷酸供体,结合HATPase结构域,引起HATPase结构域的His残基发生自体磷酸化。HKs 一般通过双组份信号转导系统(Two-component signal transduction systems,TCSs)来传递信号,双组份信号转导系统普遍存在于原核和真核生物中,主要由一个HK和一个应答调控蛋白(response regulator protein,RR)组成。双组份信号转导途径包括信号输入、组氨酸激酶自身磷酸化、应答调控蛋白磷酸化和信号输出等环节。细胞内外的环境信号引起组氨酸激酶保守的组氨酸残基发生自动磷酸化,再将磷酸基团转移到应答调控蛋白的天冬氨酸残基上,进而引起下游基因转录和翻译水平发生改变。双组份信号转导系统参与细胞生长、胁迫抗性、次级代谢产物调控、维持细胞毒力等多种机制的调控。本课题对一株具有低温生长适应性的产油酵母一红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovaae)菌株YM25235 在 15℃和 30℃培养条件下的样品进行转录组测序分析,研究该菌株低温生长适应性机制,结果显示,低温条件下YM25235菌株生长与MAPK级联信号途径呈显著相关。对MAPK级联信号通路分析发现,其检测到的73个基因中11个基因发生2倍以上的差异表达,其中9个呈下调,特别是与渗透压胁迫相关的信号转导途径中的基因均呈下调。此外,我们进一步对YM25235菌株中潜在的5个组氨酸激酶进行分析发现,仅组氨酸激酶HisK2301与菌株低温生长适应性有关,荧光定量PCR初步分析结果表明HisK2301 基因mRNA在15℃的表达水平是30℃时的2.6倍。因此推测基于组氨酸激酶HisK2301的双组份信号转导系统可能与红冬孢酵母YM25235菌株的低温生长适应性有关。根据转录组测序所获得的组氨酸激酶基因HisK2301序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增得到全长为3888bp的cDNA序列,序列分析结果表明其具有一个编码1295个氨基酸的完整开放阅读框。通过对其编码蛋白的组氨酸激酶HisK2301的氨基酸序列分析发现,其具有保守的HisKA、HATPase和REC三种组氨酸激酶结构域,N端还具有LCR结构域和6个HAMP结构域。进一步分析发现组氨酸激酶HisK2301具有两个潜在的跨膜区域,同时通过构建HisK2301的GFP融合蛋白也证实了 HisK2301是一种膜结合蛋白。这些结果初步表明组氨酸激酶基因HisK2301是一个新的潜在的具有膜结合区域的第三类真菌杂合型组氨酸激酶编码基因,而且说明真菌中的第三类组氨酸激酶不再局限于之前报道的定位于细胞质中的可溶性蛋白。为了验证组氨酸激酶基因HisK2301与低温生长适应的关系,我们首先将该基因分别插入pYES3/CT和pRH2304两个载体中,构建重组表达质粒pY3HisK2301和pRHHisK2301,经验证正确后分别转入酿酒酵母INVScl和红冬孢酵母YM25235菌株中进行表达,分析组氨酸激酶HisK2301对酵母菌株抗低温、高渗透压、盐压、过氧化压以及金属离子胁迫下的影响。结果表明,组氨酸激酶基因HisK2301能促进转基因酿酒酵母INVScl和红冬孢酵母YM25235的低温、高渗透压以及盐压的胁迫抗性。我们进一步将N端跨膜区包括LCR结构域的序列进行缺失并对缺失突变体在酿酒酵母INVScl中的功能进行分析。结果表明,缺失突变基因不能提高转基因菌株的环境胁迫抗性,这可能与跨膜区缺失导致组氨酸激酶HisK2301无法定位到细胞膜而失去对环境胁迫的感知有关。对组氨酸激酶基因HisK2301转化的红冬孢酵母YM25235过表达菌株进行脂肪酸气相色谱分析结果发现,15℃条件下基因HisK2301转化的YM25235菌株中亚油酸和α-亚麻酸含量分别较空质粒pRH2304转化菌株增加了 5.06%和1.56%,而且油酸含量减少3.6%。我们进一步对催化油酸转变为亚油酸和α-亚麻酸的限速酶△12-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA表达水平进行定量分析,结果表明在15℃时该基因mRNA表达水平明显提高,但在30℃条件下基本没有变化,说明组氨酸激酶基因HisK2301可在低温条件下特异提高RKD12的mRNA表达水平,进而增加多不饱和脂肪酸的含量,有助于红冬孢酵母YM25235菌株低温生长适应性。总之,通过本研究获得了一个新的组氨酸激酶基因HisK2301,其与红冬孢酵母YM25235菌株的低温、高渗透压和盐压抗性有关,而且还与低温条件下YM25235菌株中A12-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA 表达水平和多不饱和脂肪酸低温合成有关。本研究将有助于阐明红冬孢酵母YM25235中亚油酸和α-亚麻酸低温合成调节的信号转导途径,揭示低温条件下YM25235菌株中亚油酸和α-亚麻酸合成的调节机制,而且也将有助于进一步揭示真菌中多不饱和脂肪酸合成的调节机制,并为阐明真菌低温适应机制的研究提供参考,而且探索低温条件下多不饱和脂肪酸合成的调节机制有助于利用相关的合成调节过程,为今后大规模生产多不饱和脂肪酸的研究与应用奠定基础。