家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomous polyps，FAP)是常见的遗传性大肠癌之一，约占总大肠癌的1％，可分为经典型家族性腺瘤性息肉病(Classical FAP，CFAP)，衰减型家族性腺瘤性息肉病(Attenuated FAP，AFAP)和MYH相关性息肉病(MYH associated FAP，MAP)三种，其临床表现为青春发育期发生结直肠腺瘤，后逐渐增多，甚至满布所有结直肠粘膜，如不及时干预治疗，将发生癌变。CFAP和AFAP为常染色体显性遗传，与APC基因的变异有关，两者的主要区别为肠道腺瘤性息肉数目与癌变年龄不同，CFAP腺瘤数目较多，常在100粒以上，腺瘤癌变的年龄也较轻，而AFAP腺瘤数常在100粒以下，平均癌变年龄为55岁左右。MAP较少见，属于常染色体隐性遗传，与MYH基因突变有关，估计约占FAP的5—10％左右，目前对其是否属于FAP尚有不同的看法。在FAP的临床表型和遗传病因的研究上，国外研究已基本明确：FAP的肠内主要表现为多发性腺瘤性息肉，数目可因类型不同而有差异。肠外表现中，常见眼底视网膜色素上皮增生(CHRPE)，上消化道息肉，硬纤维瘤，肝血管瘤和牙异常等，其中CHRPE最常见，有75—80％的FAP患者可检出CHRPE，其次为上消化道息肉和硬纤维瘤。约30-80％的FAP家系能检出APC基因的突变，研究还发现了APC基因的突变位点与疾病临床表型的一些相关性。尽管国内外FAP的诊治在近几十年来有所进展，但仍然存在一些问题，对FAP腺瘤与散发性腺瘤及各类FAP的诊断主要是从临床表型(家族史，腺瘤数)出发，但单从临床表型有时很难甄别多发性的散发性腺瘤和无家族史的可疑AFAP，也不能早期判断FAP腺瘤痛变，然而，判断是否FAP腺瘤，及其癌变与否可帮助诊断FAP，及选择预防性肠切除的手术时机和预后判断。随分子生物学的发展，FAP的相关基因APC基因等的发现，及突变检测技术的改进如灵敏度高的高通量突变检测方法—变性高效液相色谱(denaturing High performance liquid chromatography，DHPLC)的应用和蛋白质组学研究方法的进展如SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption／Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry，表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱)技术的应用，因此有可能在分子水平(包括基因和蛋白水平)来明确FAP等疾病的分子特征，从而帮助鉴别诊断。因此，除临床表型分析外，应在分子水平检测APC基因的突变，同时还应在蛋白水平寻找新的生物标记来帮助早期甄别FAP腺瘤和散发性腺瘤及FAP腺瘤癌变与否等FAP和大肠癌诊治中亟待解决的问题。SELDI-TOF-MS是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法，可分析海量蛋白，已成功用于散发性大肠癌和妇科肿瘤，脑肿瘤等的早期诊断，证明为一有效的蛋白质组学研究方法，可用于寻找肿瘤相关的血清蛋白指纹图谱，但目前未见用SELDI-TOF方法研究FAP腺瘤等的蛋白指纹图谱的研究报道。至今为止，国内对FAP的临床研究多为单纯的病例分析，大样本的研究少见，对国人FAP的肠外表型特征研究不够重视，因此，对国人FAP的临床和分子表型特征还应进一步研究并充实。同时随年代变迁，如再过10～30年左右，我国原先的大家庭将逐渐消失，FAP大家系的遗传资源也将随之消失，不利于国人FAP家系的诊治和病因研究。因此，本研究对FAP家系的遗传资源进行了系统的收集和保存，对FAP临床表型尤其是CHRPE的特征等进行了深入的研究，在此基础上，应用灵敏度高的高通量突变检测方法—变性高效液相色谱(DHPLC)建立了检测APC基因突变的条件和技术平台，分析了国人FAP家系的临床表型特征和遗传表型及两者的相关性，进一步明确了国人FAP的分子基础。同时，结合散发性腺瘤，应用SELDI—TOF技术检测FAP腺瘤与散发性腺瘤、FAP腺瘤癌变者及家系健康成员的血清蛋白质指纹图谱，以发现各组的血清蛋白指纹图谱的差异，建立各组间的质谱判别模型，帮助临床判别FAP腺瘤和癌变，并为进一步了分离差异蛋白，鉴定其功能及阐明其在FAP发生发展中的作用奠定了基础。一、材料与方法：33个家系均由固定调查员(本人)入户调查收集家系资料和病例发病死亡等临床表型资料，必要时核查医院病例资料。眼底检查由同一位资深眼科医师用间接眼底镜检查。所有家系调查前均签署知情同意书，并绘制家系图，采集家系先证者，患者和家系成员的外周血淋巴细胞和血清进行分析。基因突变检测先抽提DNA并以降落式PCR扩增APC基因各外显子，由DHPLC进行突变筛选，发现异常峰者进行测序鉴定，并与网络数据进行比对，并对FAP家系的临床表型，基因表型特征进行相关分析。血清蛋白指纹图谱检测用SELDI—TOF质谱仪，以CM10蛋白芯片分析FAP腺瘤及散发性腺瘤等各类对象的蛋白表达差异，并用支持向量机等生物信息学方法筛选各组间的差异蛋白峰，建立FAP腺瘤与散发性腺瘤、FAP腺瘤癌变者、家系健康成员等之间的血清蛋白指纹图谱判别模型。二、结果(一)、国人FAP家系收集与保存及临床表型特征：1．收集了33个FAP家系资源，其中CFAP家系26个，AFAP家系4个，SAFAP家系3个，对其中31个家系进行了采样，收集家系成员血样132份，对125例患者中的116个家系成员包括26个先证者成功地应用环孢菌素A建立了EB病毒转化的外周血淋巴细胞永生化细胞株，成功率为92.8％。2．国人FAP的临床表型特征为：肠内主要表现为结直肠的多发性腺瘤性息肉，肠外表现中，CHRPE最常见，其次为胃息肉和腹腔纤维瘤。3．国人CFAP和AFAP两类家系临床表型的主要区别除肠道息肉数的差异外，主要为：结直肠肿瘤平均数目CFAP家系更多，腺瘤的平均癌变年龄CFAP为41岁，较AFAP(57岁)年轻16岁，CHRPE的检出率CFAP为94.12％，较AFAP(66.67％)高。4．研究明确了国人FAP常见和典型的3种CHRPE形态，发现眼底后极部是国人FAP患者CHRPE最多发的部位，71.1％患者有一色素斑最大直径大于0.5PD。发现国人FAP的CHRPE的形态、部位和大小分布特征与国外FAP有较大差异。5．发现国人CHRPE检出率很高，家系检出率为90.91％，FAP患者和突变基因携带者检出率为91.84％。研究提出了国人CHRPE的诊断标准，并证明其对FAP和突变基因携带者检测的灵敏度为91.84％，特异度为100％。(二)、国人FAP家系的APC基因突异特征及其与临床表型的相关性：1．国人FAP家系APC基因的突变检出率为48.39％，SNP的检出率为45.16％。2．研究发现了4个新的突变和1个新的SNP位点及3例不同的内含子突变。证明了DHPLC能检出APC基因的突变，尤其对SNP检出效果更好。3．研究表明，在APC基因的突变中，移码突变占86.67％，无义突变占13.33％，说明移码突变是国人APC基因突变的主要方式。在突变位点上，15号外显子突变最常见，约占86.67％。4．基因表型与临床表型的相关性研究结果表明，轻型FAP APC基因突变位点常多位于基因5’端，1309号密码子突变可导致严重表型的FAP，但有例外；合并CHRPE的FAP患者其APC基因突变位点也位于基因5’端，主要位于基因的677-1309密码子，均与国外报道的有所不同，说明国人FAP有其不同于国外FAP的自身特征。(三)FAP腺瘤与散发性腺瘤等的SELDI—TOF的分析结果：1．研究初步证明了SELDI可用于寻找区分FAP腺瘤和散发性腺瘤，FAP腺瘤与FAP腺瘤癌变者等的血清差异表达蛋白峰，发现：1)质荷比为3.17，4.18，4.29，5.64，13.75kDa的蛋白峰在FAP患者中(包括腺瘤及癌变者)高表达，而在散发性腺瘤中低表达。2)质荷比为2.77，2.76，9.40，9.24和4.60kDa m／z的蛋白质峰在FAP腺瘤癌变者中高表达，而在FAP腺瘤中低表达。3)发现质荷比为8.47和3.40kDa的蛋白峰在APC基因突变者中分别高表达和低表达，可能与FAP的发病有密切关系。这些差异蛋白的发现为进一步分析FAP腺瘤及其癌变机理提供切入点。2．以检出的差异表达的蛋白峰为基础，用生物信息学方法建立了区分FAP腺瘤与散发性腺瘤，家系突变基因携带者，FAP腺瘤癌变者和家系健康成员间的质谱判别模型，为临床鉴别FAP腺瘤与散发性腺瘤及FAP腺瘤癌变提供了一新的思路和方法。三、结论1．本研究系统收集和保存了国人FAP家系遗传资源，并应用环孢菌素A使EB病毒转化淋巴细胞的成功率达到90％以上。2．明确了国人FAP的临床表型特征，发现国人CHRPE检出率很高，家系检出率为90.91％，FAP患者和突变基因携带者检出率为91.84％。CHRPE对FAP和突变基因携带者的灵敏度和特异度分别为91.84％和100％。明确了国人FAP较特异的3种CHRPE形态，证明了CHRPE可有效用于无症状的FAP和突变基因携带者的筛查。提出CHRPE应作为国人FAP诊治和筛查的常规和首要方法。3．发现了4种新的导致蛋白编码改变的突变，3例内含子的突变和1个新的SNP位点。发现国人FAP家系APC基因中SNP的检出率较高。证实移码突变是国人APC基因突变的主要方式，15号外显子突变最多见。发现国人FAP基因表型与临床表型的相关性研究结果与国外报道的有所不同，说明国人FAP有其不同于国外FAP的自身特征。4．研究初步筛选出并证明了SELDI可用于寻找区分FAP腺瘤和散发性腺瘤，FAP腺瘤与FAP腺瘤癌变者等的生物标志物并建立了相应的质谱判别模型，为进一步分析FAP及其癌变机理提供了线索，也为临床诊断FAP腺瘤癌变和其预防性肠切除手术时机的选择提供了参考依据。四、创新性1．发现了4种新的APC基因编码区突变，3例内含子的突变和1个新的SNP位点。发现国人FAP家系APC基因SNP的检出率显著高于国外，达41.94％。国人FAP基因表型与临床表型的相关性研究结果与国外报道的有所不同，说明国人FAP有其不同于国外FAP的自身特征。2．发现国人FAP的CHRPE检出率很高，家系检出率为90.91％，FAP患者和突变基因携带者检出率为91.84％。提出了国人CHRPE的诊断标准，其对FAP和突变基因携带者检测的灵敏度为91.84％，特异度为100％。证明了CHRPE对筛选无症状的FAP患者和突变基因携带者具较高的临床应用价值。3．明确了国人FAP较特异的3种CHRPE形态，发现国人FAP的CHRPE的形态、部位和大小分布特征与国外FAP有较大差异。CHRPE与APC基因的突变位置有关，主要在基因5’端。4．首次用SELDI—TOF质谱仪筛选出一批FAP腺瘤与散发性腺瘤、FAP腺瘤癌变者、家系健康成员等之间的差异蛋白峰，建立了相应的质谱判别模型。差异蛋白峰的发现为进一步研究FAP腺瘤及其癌变的机理提供了研究的切入点，也为临床鉴别FAP腺瘤与散发性腺瘤和FAP腺瘤癌变提供了一新的思路和方法。