脓毒症(sepsis)是针对感染的宿主免疫反应失调导致危及生命的器官功能障碍,是目前世界范围内感染致死最主要的原因。全世界范围内每年超过3000万人罹患脓毒症,其中多达四分之一甚至更多的人死亡。脓毒症的治疗给全球医疗卫生事业带来了巨大的负担,尤其是低收入和中收入国家。目前脓毒症治疗主要是使用抗生素和支持疗法,但这些疗法在脓毒症引起全身炎症和器官功能障碍中的治疗效果有限。因此,迫切需要临床和科研工作者探索和发展更为有效的治疗手段。在过去的十几年中,细胞疗法已成为脓毒症治疗新希望之一。间充质干细胞(MSC)是广泛存在于外周血、骨髓、脂肪、脐带、脐带血、胎盘等几乎所有组织基质的成体干细胞,具有快速增殖、高分化潜能和自我更新复制的能力,可诱导分化为人体多种细胞,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。MSC最显著的特性在于其具有较强的免疫调节作用,且来源丰富、易于分离和体外扩增,使其成为细胞治疗的理想种子细胞。近年来,多项试验研究表明MSC能够调节脓毒症的病理生理过程,而基于MSC的细胞疗法是脓毒症治疗的新手段。其主要机制在于MSC作为免疫反应的强效调节剂,可以使固有和适应性免疫应答恢复平衡;通过抗菌和抗炎特性抑制脓毒症中的细菌增殖和细胞因子风暴;通过抗细胞凋亡能力减少细胞死亡和组织损伤。尽管MSC在脓毒症治疗中显示了一定的潜力,但疾病条件下MSC移植入体内后,在缺氧、血清剥夺、炎症、热休克或氧自由基等作用下,MSC快速凋亡导致其体内存活率低。此外,静脉注射的MSC只有少部分(0.001-1%)可以到达炎症部位。归巢能力降低可能是由于体外培养条件不完善或MSC传代次数多,使得MSC表面的趋化因子受体表达下降。鉴于MSC移植后归巢靶组织的数量有限,产生的治疗性和抗炎分子效力不够强,最近多项研究对MSC进行基因修饰,从而增加了MSC的治疗效能。CXC型趋化因子受体2(CXCR2)属于G蛋白偶联受体家族,是趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8的配体,这些趋化因子在炎症部位均有较高表达水平。近年来,一些研究显示MSC表达趋化因子受体后能够有效募集到炎症部位发挥相应的生物学效应。本实验分离了小鼠骨髓和人脐带来源的MSC,分别通过cxcr2基因修饰,探索其是否能增强MSC归巢能力,进而在LPS致脓毒症动物模型中观察其治疗效应。本研究的主要实验方法和结果如下:1.小鼠骨髓MSC分离、cxcr2基因修饰及治疗LPS所致脓毒症的评价研究首先采用全骨髓贴壁法分离BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSC),获得经传代纯化后的第三代BMSC,通过形态学观察、流式细胞术鉴定细胞表面分子、成骨诱导分化对其进行鉴定,证实分离的BMSC符合国际干细胞协会的标准。同时提取全骨髓细胞的RNA,反转录为cDNA作为模板,以Genbank中小鼠cxcr2序列设计的引物PCR扩增cxcr2片段,并插入本室构建的慢病毒载体pLenti-GZ,对其进行菌液PCR、酶切鉴定,并交由公司进行测序,测序结果正确的命名为pLenti-cxcr2-GZ。将pLenti-cxcr2-GZ与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,收集慢病毒上清,以20%的蔗糖为垫子浓缩纯化慢病毒后,通过离心法感染BMSC,经筛选后获得cxcr2稳定转染的BMSC(CXCR2-BMSC)。流式细胞术、RT-PCR结果显示CXCR2-BMSC中CXCR2明显高表达。Transwell实验证明cxcr2基因修饰的BMSC比未修饰的BMSC具有较强的迁移能力。以6~8周龄的BALB/c雄性小鼠,采用腹腔注射LPS方法建立脓毒症动物模型,LPS所致脓毒症模型的多个脏器中趋化因子cxcl1、cxcl2、cxcl5、cxcl9、cxcl10、cxcl12 mRNA表达水平明显上调。给予尾静脉注射MSC治疗后,与GZ-BMSC相比,CXCR2-MSC移植组到达肺部组织的数量明显较多,显示了较好的组织靶向性。GZ-BMSC、CXCR2-BMSC移植组均可一定程度上减轻炎性因子水平、病理损伤和肺干湿比等方面,但未观察到CXCR2-BMSC移植组有明显增强治疗效应。2.人脐带MSC分离、cxcr2基因修饰及治疗LPS所致脓毒症的评价研究经产妇及家属同意获得足月新生儿的脐带,按照组织块贴壁法进行脐带间充质干细胞(hUCMSC)的分离培养。培养至第三代时通过形态学观察、流式细胞术鉴定细胞表面分子、三系分化鉴定其分化潜能,鉴定结果显示分离的hUCMSC符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准。将上述制备的pLenti-cxcr2-GZ病毒瞬时感染hUCMSC,流式细胞术检测和实时PCR检测CXCR2-hUCMSC细胞中cxcr2明显高表达,阳性率约78%。CXCR2-hUCMSC细胞增殖能力提高,细胞周期未改变,分子标志符合间充质干细胞特征。Transwell实验结果表明,与hUCMSC相比,CXCR2-hUCMSC细胞迁移能力明显增强,在体内也增加了CXCR2-hUCMSC到达靶组织的数量。以6~8周龄的BALB/c雄性小鼠,腹腔注射LPS制备脓毒症模型,静脉移植GZ-hUCMSC和CXCR2-hUCMSC,均能减轻炎性因子水平、肺组织损伤,其中CXCR2-hUCMSC组稍明显一些。综上,本研究分离获得了两种来源的MSC,其生物学特征均符合国际干细胞标准,经cxcr2基因修饰后的MSC不改变其干细胞生物学特性,且在体内外实验中都显示两种不同来源MSC在CXCR2修饰后均能显著增加其归巢至靶组织。在LPS所致脓毒症动物实验中,与LPS组相比,BMSC和hUCMSC均改善脓毒症相关症状,而CXCR2修饰的BMSC与单纯的BMSC相比并没有显著的增强效果,可能与骨髓间充质干细胞在传代过程中免疫调节能力降低有关;CXCR2-hUCMSC较单纯hUCMSC增强了其治疗效果。本研究为CXCR2修饰MSC治疗脓毒症提供了实验基础,其治疗效能需要进一步提升。