背景和目的前列腺癌是男性泌尿系统中常见的恶性肿瘤。据调查显示,2017年美国预计新发肿瘤患者将达到1688780人,而由肿瘤造成的死亡人数将达到600920人,其中前列腺癌的新发病例高达161360例,死亡病例也将达到26730例,前列腺癌是美国男性患者中发病率最高,死亡率第二高的恶性肿瘤。前列腺癌最常见的转移部位是骨,一项尸检结果提示70%以上前列腺癌会发生骨转移。前列腺癌发生转移之前,其五年的生存率几乎可达100%,可一旦发生骨转移之后,其五年生存率只有不到30%。骨转移可以引起许多严重的并发症,比如难治性疼痛、病理性骨折、脊髓压迫等等,严重影响患者的生活质量。骨转移是前列腺癌的主要死亡原因,但是目前仍然没有有效的方法可以治愈前列腺癌骨转移,虽然针对骨转移并发症的治疗可以缓解患者的疼痛,提高其生活质量,但并不能改善患者远期的生存率。因此,研究前列腺癌骨转移发生的过程及其具体机制,寻找新的免疫治疗靶点对于将来治疗前列腺癌骨转移具有非常重大的意义。肿瘤的发生与基因表达的异常相关。经典遗传学认为,核酸是遗传的分子基础,核酸碱基的排列顺序决定了生物的遗传特征。虽然生物体内所有细胞所含有的遗传信息相同,但由于基因的表达模式不一样,使得原本由同一个受精卵分裂而来的细胞经过分化之后,便有了不同的形态和功能。人们把这种DNA序列不发生变化,而基因表达发生可遗传改变的现象,定义为表观遗传现象。细胞内基因表达水平发生改变,例如致癌基因过表达或者抑癌基因表达缺失,就会引起疾病甚至是肿瘤的发生。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)就是一个在前列腺癌组织中异常高表达的基因。首先是由Reiter等利用代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)在LAPC-4移植瘤中发现。PSCA基因定位在染色体8q24.2,含有660bp碱基,编码一个含糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)结构的膜蛋白。目前许多的研究已经证实了PSCA在前列腺癌组织中高表达,尤其在发生骨转移的前列腺癌组织中几乎全部呈强阳性表达,并且PSCA的表达与前列腺癌的临床分期,Gleason评分,雄激素抵抗进展呈正相关。PSCA有可能是一个良好的前列腺癌免疫治疗靶点。但是目前关于PSCA的研究主要集中在免疫治疗靶点和肿瘤生物学标记等方面,而PSCA在前列腺癌中具体的生物学功能仍然不清楚。我们前期研究初步探讨了PSCA对前列腺癌细胞增殖和侵袭转移的影响及其作用机制,在本课题中,我们进一步研究PSCA对前列腺癌骨转移的影响及其可能的作用机制。方法1.免疫组织化学检测前列腺癌组织中PSCA的表达水平我们临床收集局限性前列腺癌组织标本29例和发生骨转移的前列腺癌组织标本21例,用免疫组化的方法检测PSCA蛋白在前列腺癌组织中的表达水平,并分析其表达与前列腺癌骨转移之间的关系;2.体内动物实验观察PSCA表达对前列腺癌细胞骨转移的影响我们前期已经构建了稳定过表达PSCA的LNCAP-PSCA细胞株和稳定沉默PSCA的DU145-shPSCA细胞株。通过胫骨内注射的方法构建裸鼠前列腺癌骨转移模型,定期用X片观察肿瘤的大小、部位和骨质破坏情况;8周老鼠牺牲后,取骨转移瘤组织做免疫组化分析PSCA的表达情况;3.体外实验观察PSCA表达对前列腺癌细胞粘附能力的影响采用体外细胞粘附实验检测PSCA表达对前列腺癌细胞与细胞外基质蛋白和骨髓内皮细胞(bone marrow endothelial cell,BMECs)粘附能力的影响;采用transwell迁移实验探讨PSCA对前列腺癌细胞跨内皮转移能力的影响;4.PSCA调控前列腺癌细胞粘附能力的作用机制通过实时荧光定量PCR、Western Blot等技术检测PSCA表达对前列腺癌细胞中整合素表达和NF-κB信号通路的影响;荧光素酶报告系统检测PSCA表达对NF-κB转录活性的影响;免疫共沉淀以及质谱分析技术用于研究可能与PSCA相互作用的蛋白。结果1.PSCA在前列腺癌骨转移组织中高表达,且PSCA促进前列腺癌骨转移免疫组化结果显示PSCA在29例局限性前列腺癌组织中阳性表达有21例(72.4%),在21例骨转移的前列腺癌组织中阳性表达有18例(85.7%);且在局限性前列腺癌组织中免疫活性评分The Immunoreativity sores(IRS)为5.00±2.57,低于在骨转移的前列腺癌组织中IRS的7.86±3.37,差异具有统计学意义(P=0.002)。体内动物实验结果显示:LNCAP-vector、LNCAP-PSCA和DU145-NC、DU145-shPSCA组骨转移灶形成数目分别为2/5、4/5和4/5、0/5,DU145-NC组比DU145-shPSCA组引起更严重的骨质破坏;DU145-sh PSCA组骨转移标本中PSCA的染色明显弱于DU145-NC组;而LNCAP-PSCA组骨转移标本中PSCA表达明显强于LNCAP-vector组(all P<0.05)。说明PSCA过表达可以促进前列腺癌细胞发生骨转移。2.PSCA促进前列腺癌细胞与胶原蛋白collagen I和骨髓内皮细胞的粘附为了研究PSCA促进前列腺癌骨转移的作用机制,我们用体外粘附实验检测PSCA表达对前列腺癌粘附能力的影响。结果显示:与LNCAP-vector细胞相比,高表达PSCA的LNCAP-PSCA细胞对collagen I和骨髓内皮细胞有更高的粘附能力;沉默PSCA表达后,DU145-shPSCA细胞的粘附能力降低;并且,transwell侵袭实验显示LNCAP-PSCA组跨内皮细胞转移细胞(Transendothelial migration,TEM)数目显著高于LNCAP-vector空载体组,而DU145-shPSCA组TEM细胞数目明显少于DU145-NC组,差异具有显著意义(P<0.05)。但是,PSCA对前列腺癌细胞与其他细胞外基质蛋白(例如:纤连蛋白,层粘连蛋白和玻连蛋白)的粘附无影响;3.PSCA调节前列腺癌细胞中ITGA2和ITGA4的表达细胞粘附能力是由细胞表面粘附分子的表达所决定的,所以我们用PCR和Western Blot检测PSCA表达对前列腺癌细胞表达整合素的影响。结果显示:在LNCAP细胞中上调PSCA表达后,ITGA2和ITGA4的表达水平也明显升高;而下调DU145细胞中PSCA表达后,ITGA2和ITGA4的表达也明显降低,说明PSCA可以调节前列腺癌细胞中ITGA2和ITGA4的表达水平。符合体外粘附实验结果,PSCA对前列腺癌细胞中整合素ITGA5、ITGB1和ITGB3的表达无影响;为了验证是否整合素ITGA2和ITGA4是否参与PSCA介导的前列腺癌细胞粘附,我们在PSCA上调的LNCAP-PSCA细胞中沉默整合素的表达,结果显示:ITGA2-siRNA可以拮抗PSCA增强的前列腺癌细胞与collagen I的粘附;同样地,ITGA4-si RNA可以逆转PSCA介导的前列腺癌细胞与BMECs细胞的粘附和TEM。说明PSCA通过调节整合素的表达,从而影响前列腺癌细胞的粘附能力;4.PSCA通过提高NF-κB的转录活性来调节ITGA2和ITGA4的表达我们进一步探讨PSCA调节整合素表达的分子机制。我们检索the JASPAR database(http://jaspar.genereg.net/)数据库,预测ITGA2(-482~-472)和ITGA4(-800~-790)的启动子序列上可能的NF-κB结合位点。并利用PCR方法,克隆出含NF-κB结合位点和相应突变位点的ITGA2和ITGA4的启动子序列,构建重组荧光素酶载体和相应的突变型质粒。结果显示:转染野生型重组荧光素酶载体时,相比较LNCAP-vector细胞,NF-κB的转录活性在LNCAP-PSCA细胞中明显升高,而启动子上的NF-κB结合位点发生突变后,PSCA不会再引起NF-κB转录活性升高;同样地,转染野生型重组荧光素酶载体时,相比较DU145-NC细胞,NF-κB的转录活性在DU145-shPSCA细胞中明显降低,而启动子上的NF-κB结合位点发生突变后,PSCA对NF-κB的转录活性无影响;我们进一步应用NF-κB抑制剂QNZ抑制NF-κB的活性。PSCA促进LNCAP细胞的TEM和细胞粘附能力、ITGA2和ITGA4的表达,这种促进作用可以被QNZ所抑制,说明NF-κB信号通路参与PSCA介导的前列腺癌细胞粘附和整合素的表达;5.PSCA是人前颗粒体蛋白PGRN潜在的功能性受体我们成功构建了PSCA和Flag融合蛋白的重组pcDNA3.1(+)-PSCA-Flag表达载体,利用免疫共沉淀和质谱分析的方法确定人前颗粒体蛋白(Progranulin,PGRN)可能是PSCA潜在的配体。ELISA结果显示DU145和PC3分泌较多的PGRN,LNCAP和C4-2几乎不分泌PGRN。体外功能实验显示,在DU145细胞株中,沉默内源性PGRN表达后,前列腺癌细胞与BMECs细胞的粘附减弱,且前列腺癌细胞的TEM能力降低,当补充外源性重组PGRN蛋白后,DU145细胞的粘附和TEM能力均提高,当我们进一步沉默PSCA表达后,细胞粘附和TEM能力再次受到了抑制;而在LNCAP细胞株中,当没有PSCA表达时,外源性PGRN不能刺激LNCAP细胞与骨髓内皮细胞的粘附和跨内皮细胞转移,而在LNCAP-PSCA细胞株,加入外源性PGRN可以明显提高LNCAP细胞的粘附和TEM能力,说明PGRN在前列腺癌中发挥功能需要有PSCA的存在。结论1.PSCA在前列腺癌骨转移组织中高表达,且PSCA过表达可以促进前列腺癌细胞发生骨转移;2.PSCA表达促进前列腺癌细胞与Collagen I和BMECs细胞的粘附,从而诱导前列腺癌发生骨转移;3.PSCA通过调节前列腺癌细胞中整合素ITGA2和ITGA4的表达,来增强前列腺癌细胞与Collagen I和BMECs细胞的粘附,NF-κB信号通路参与PSCA介导的前列腺癌细胞粘附和整合素的表达;4.PSCA是PGRN潜在的功能性受体,PGRN的生物学功能依赖于PSCA的表达。