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颗粒细胞增殖分化对哺乳动物卵巢卵泡发育至关重要。颗粒细胞是主要的卵泡细胞类型,对于维持卵泡内环境,促进卵母细胞生长成熟,参与卵泡发育的调节都是十分重要的,颗粒细胞还为卵母细胞发育提供信息和营养。卵巢中绝大多数卵泡不能发育成熟,它们在发育的各个阶段发生退化闭锁;也就是说,闭锁是卵泡发育的主要归宿,研究表明颗粒细胞凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因,研究颗粒细胞凋亡的机制是了解卵泡发育与闭锁的关键。淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿的主要有效成分之一。已有的研究表明,灌服淫羊藿苷可促进卵泡发育。本试验在体外培养猪完整有腔卵泡条件下,通过添加淫羊藿苷,研究其对猪卵巢卵泡发育的影响,侧重了解淫羊藿苷对卵泡颗粒细胞凋亡的影响和抗氧化作用,研究PI3K/AKT信号通路在淫羊藿苷作用中的地位,为了解传统中药淫羊藿的作用机制及开发利用提供参考。主要的研究内容与结果如下:1、ICA对猪体外培养卵泡颗粒细胞凋亡的影响分离猪3～5 mm健康有腔卵泡,设置不同浓度ICA(0、0.1、1和10 μg/mL)添加组并作体外培养12和24 h后,分别收集各组卵泡颗粒细胞。流式细胞分选术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA相对表达水平。结果表明,培养时间相同的各ICA浓度组与对照组间并无明显的眼观特征变化,但培养时间从12h增加至24 h,则可见卵泡毛细血管消失,卵泡液浑浊,颗粒细胞脱落,包被卵母细胞的卵丘细胞减少。卵泡体外培养12h,添加1μg/mLICA组颗粒细胞凋亡率较对照组显著下降(93.33±0.18%对96.37±0.86%,P<0.05),各试验组Caspase-3和Bax mRNA表达量均降低,且与对照组有显著差异(P<0.05);各试验组Bcl-2 mRNA 表达量均显著升高(P<0.05),其中以 1 μg/mL 组 Caspase-3、Bax mRNA表达量最低,Bcl-2 mRNA表达量最高。培养24h,1和10μg/mLICA组颗粒细胞凋亡率较对照组显著降低(91.33±0.13%和 92.17±2.23%对 96.30±0.50%,P<0.05),0.1和 1 μg/mLICA 试验组 Caspase-3 和 Bax mmRNA 表达量显著降低(P<0.05),1 μg/mL 组Caspase-3、Bax mRNA表达量最低,所有试验组Bcl-2 mRNA表达量显著升高(P<0.05),1 μg/mL组Bcl-2 mRNA表达量最高。本试验表明,ICA在卵泡培养过程中可明显抑制颗粒细胞凋亡,这一作用主要是通过上调Bcl-2、下调Bax和Caspase-3基因表达实现的;ICA的最佳添加浓度为1 μg/mL。2、ICA通过PI3K/AKT信号通路抑制颗粒细胞凋亡为了解淫羊藿苷(ICA)抑制颗粒细胞凋亡的分子作用机制,侧重探究PI3K/AKT信号通路与ICA作用的关系。用已建立的猪卵泡体外培养模型,加入1 μg/mLICA和PI3K抑制剂LY294002,设置4个组,即对照组、ICA组、ICA+LY294002组和LY294002组,罗丹明123染色流式检测各组细胞凋亡率,Western Blot检测AKT、p-AKT及凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量。结果表明,培养12和24 h后,各组细胞凋亡变化趋势基本一致,LY294002组颗粒细胞凋亡高于对照组和ICA组(P<0.05),ICA组颗粒细胞凋亡则显著低于对照组(P<0.05),ICA+LY294002组明显低于LY294002组颗粒细胞凋亡(P<0.05)。培养12和24 h各组p-AKT/AKT比值及Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达具有一致的变化趋势,ICA组p-AKT/AKT 比值、Bcl-2 表达最高(P<0.05),Caspase-3、Bax 表达最低(P<0.05),LY294002 组的 p-AKT/AKT比值、Bcl-2 表达最低(P<0.05),Caspase-3、Bax 表达最高(P<0.05);与LY294002组相比,ICA+LY294002组p-AKT/AKT 比值、Bcl-2表达显著升高(P<0.05),Caspase-3、Bax表达显著降低(P<0.05)。这些结果提示:在猪卵泡无血清培养体系中,1 μg/mL ICA通过激活PI3K/AKT信号通路上调Bcl-2,下调Caspase-3和Bax蛋白表达,进而抑制颗粒细胞凋亡。3、ICA对猪卵泡颗粒细胞抗氧化能力的影响旨在研究淫羊藿苷(ICA)对体外培养猪卵泡颗粒细胞抗氧化能力的影响。添加1 μg/mL淫羊藿苷体外培养直径3～5mm猪完整卵泡,DCFH-DA探针法流式细胞仪检测颗粒细胞内活性氧(ROS)水平,抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒检测超氧阴离子水平(O2-),超氧化物歧化酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒和过氧化氢酶试剂盒分别检测颗粒细胞CAT、GSH-Px和SOD的活性,RT-PCR检测抗氧化酶基因CAT、GSH-Px、SOD1和SOD2表达。结果显示,ICA可显著降低猪卵泡体外培养12h组的颗粒细胞ROS水平(P<0.05),O2-水平降低,但与对照组无差异(P>0.05),抗氧化酶CAT和SOD的活性均较对照组显著升高(分别为7.64±1.03 U/mg 对 3.19±0.71 U/mg,P<0.05 和 19.33±0.14 U/mg 对 8.3±3.95 U/mg,P<0.05),但只有CAT基因表达显著升高(P<0.05),SOD1和SOD2的基因相对表达量无明显变化(P>0.05);GSH-Px 的活性跟对照组无显著差异(144.15±25.68 U/mg 对 68.32±11.58 U/mg,P>0.05),其基因表达却显著增加(P<0.05)。培养猪卵泡24h,颗粒细胞中ROS水平和02-水平与对照组无明显差异(P>0.05),3个抗氧化酶中只有CAT活性显著升高(5.71±0.59 U/mg对1.44±0.721 U/mg,P<0.05),它的基因表达也明显升高(P<0.05),SOD 活性虽与对照组无异(12.13±0.5 U/mg 对 11.69±1.99 U/mg,P>0.05),但SOD2基因相对表达却呈明显的上升(P<0.05)。试验表明,ICA可提高抗氧化酶活性,在猪卵泡体外培养体系中表现出明显的抗氧化作用。