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癌症每年要吞噬数百万人的生命,给人们的生活带来了极大的困扰。在所有的癌症中,肺癌的危害最为严重,其发病率和致死率均列首位。肺癌严重威胁着我国人民的生命与健康,而且癌症的治疗花费巨大,治疗周期较长,给家庭和社会带来了沉重的负担。因此,研究肺癌的发病机理,寻找治疗肺癌的新靶点对人类的生命健康至关重要。Raf 激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)是逆转录病毒致癌基因 v-Raf的同源蛋白,它是癌症发生的关键激酶,它与肺癌的发病、治疗和预后直接相关。A-Raf是Raf激酶家族成员之一,其生物学功能至今不清,可能参与了能量代谢的调节和细胞的转化。此外,部分研究表明A-Raf的突变可导致肺癌、卵巢癌和大肠癌。有研究报道A-Raf-S214C突变体能转化支气管表皮细胞,使其发生癌变,在朗格汉氏增生症中也发现该突变。因此,调控A-Raf激酶有望成为治疗癌症的重要手段。GRP78和PARP1均为A-Raf激酶的结合蛋白。前者参与内质网应激,可维持内质网稳态,而且其在某些肿瘤细胞中呈高表达;后者主要参与DNA损伤修复和介导细胞凋亡。我们也可通过调控其表达,来研究其表达水平的上调、下调或者其活性被抑制时对肿瘤细胞的影响,寻找更为有效的治疗肿瘤的新靶点。本研究主要对Raf激酶家族的三个成员(A-Raf,B-Raf和C-Raf)之一 A-Raf激酶进行系统研究。首先是在实验室成功构建A-Raf质粒的基础上,成功构建了其突变体A-Raf S214C的质粒及稳定细胞系。接下来我们利用免疫共沉淀技术和质谱技术,得到A-Raf激酶结合蛋白谱。我们挑选出与肿瘤发生相关的结合蛋白GRP78和PARP1,通过siRNA、过表达、基因敲除等手段对其表达水平进行调控,研究其对肺癌细胞(A549)功能的影响。通过研究A-Raf S214C突变体对ERK信号作用,我们发现,A-Raf S214C突变体是A-Raf的激活突变体,其对MAPK信号通路下游信号分子ERK的磷酸化能力较A-Raf更强。本研究还成功构建了 A-Raf激酶结合蛋白GRP78和PARP1蛋白在A549细胞中的基因敲降稳定细胞系和高表达稳定细胞系。通过CCK8实验、细胞划痕实验及Transwell实验证明,敲降PARP1后的A549细抗凋亡能力增加,细胞的迁移能力也增加。这些结果为我们研究通过调控PARP1来治疗癌症提供了新的依据。本研究将为研究A-Raf激酶突变体的致癌机理提供新的线索,通过对Raf激酶结合蛋白深入研究,为治疗A-Raf激酶相关的疾病,特别是以肺癌为代表的癌症提供新的靶点和方法。