腰椎手术失败综合征(failed back surgery syndrome,FBSS)指一次或多次腰椎手术后,患者仍然出现复发性和/或持续性的下腰部疼痛,伴/不伴放射性神经痛,全球发生率高达10%～40%。造成FBSS有多种因素,围绕围手术期的时间节点,可将因素概括为术前、术中、术后因素。术前因素主要包括:①患者的心理社会因素;②手术相关因素;③诊断遗漏因素。术中因素主要包括:①手术技巧欠佳;②术中手术节段定位错误;③过度减压。术后因素主要包括:①椎间盘突出的复发;②椎间隙感染;③硬膜外粘连(epidural adhesion,EA)。椎板切除术为硬膜外腔隙的手术操作,术后愈合过程中硬膜外瘢痕组织的产生是难以避免的,过度增生的硬膜外瘢痕组织随着不断成熟形成硬膜外纤维化(epidural fibrosis,EF),可对神经根形成挤压、栓系,同时干扰脑脊液流动,最终导致术后症状的发生、加重。EA目前已成为引起FBSS的重要原因之一。目前,在EA治疗方面,广大学者已达成共识,最佳的治疗方法即为预防EA形成。国内外广大学者在预防EA形成方面做了大量的临床与基础研究工作,近期研究表明,已有学者通过动物模型对EA预防做了广泛尝试,包括非甾体抗炎药、免疫抑制剂、钙通道阻滞剂、干细胞移植、自体脂肪移植、骨水泥移植、药物凝胶应用、蜂蜜等,这些研究均被证实可在一定程度上达到预防EA形成的目的。但迄今为止,尚没有一种方法可在临床得以广泛推广。丹酚酸B(salvianolic acid,Sal B)是丹参的根茎提取物,为丹参主要的水溶性成分之一,也是临床上注射用丹参多酚酸盐的主要构成成分。近年来已有Sal B在抗纤维化、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抑制细胞凋亡、清除自由基等方面的应用和研究报道。已有学者通过Sal B在肝纤维化抑制方面、减缓肺纤维化进展方面、防治糖尿病肾病方面、肿瘤杀伤方面、抑制缺血再灌注后脑血管炎症方面、治疗神经退行性疾病方面等展开了一些研究,并取得了一定成绩。基于上述研究背景,本课题拟采用椎板切除的动物模型,探究Sal B在预防硬膜外粘连方面的安全性、可行性与疗效性,并初步探索其作用机制。整体研究分为两个部分:第一部分丹酚酸B预防大鼠椎板切除术后硬膜外粘连的可行性研究。在本部分研究中,60只Wistar大鼠随机分为Sal B治疗组、Vehicle对照组、单纯手术对照组,每组20只。将丹酚酸B溶于生理盐水中制备成浓度为7.5mg/ml的SalB盐水溶液。以电子秤称重动物,以水合氯醛行腹腔注射进行麻醉,注射量根据动物体重(0.3ml/100g)。麻醉满意后对大鼠进行编号标记,根据经典的动物腰椎板切除术进行标准化造模:选择L1、L2节段备皮处理,以碘伏反复扩大消毒3遍。大鼠铺巾后取俯卧位,手术入路取背侧的正中手术切口,长度约为4～5cm,以尖刀逐层切开皮肤,并剪开深筋膜,钝性分离L1～L2椎体椎旁肌,充分暴露L1～L2棘突,以咬骨钳整体将棘突咬除,以蚕食法咬除椎板,显露L1节段的硬脊膜,所开的骨窗约为4mm×5mm。以生理盐水冲洗伤口后行止血,无明显出血点后关闭手术伤口。造模后观察大鼠麻醉复苏情况,待度过危险期后即行药液灌胃治疗:Sal B治疗组采用丹酚酸B药物溶液灌胃治疗,剂量为30mg/kg/d,Vehicle组给予等体积的生理盐水进行灌胃治疗,单纯手术对照组不予治疗干预。术后大鼠保持分笼饲喂,每笼不超过3只,室温需维持在20～28℃之间。术后需进行连续3天的肌肉注射抗生素,同时密切观察大鼠伤口情况,防止感染。造模4周后,以随机原则从每组中抽选动物。从每组动物中抽选出5只进行Rydell评分宏观评估;从每组动物中抽选出5只,行过量麻醉处死,沿原手术切口进入,暴露术野,小心剪取硬膜外瘢痕组织,烘干组织标本,并将组织标本冷冻贮存,行硬膜外瘢痕组织羟脯氨酸含量测定;从每组动物抽选出5只,行过量麻醉致死后,沿原手术切口进入,准确定位并完整暴露L1节段椎体,以生理盐水及PFA溶液灌注固定后,将L1椎体整体取下浸入至脱钙试剂液中,待脱钙满意后行石蜡包埋并行组织块切片,切片后行马松三染色、苏木精伊红染色、VEGF免疫组织化学染色;从每组动物中抽选出5只,行过量麻醉处死,沿原手术切口进入,取硬膜外瘢痕粘连组织,行烤箱标本烘干,行Real-time PCR检测硬膜外瘢痕组织中炎性因子表达情况。采用SPSS软件包对所得结果进行统计学分析,所得量化数据以X±s表示,采用单因素方差分析,采用q检验进行组间数据的比较,以P<0.05为差异有统计学意义。本组研究的大鼠术前可见感觉敏锐,行动敏捷,对外界反应灵敏,毛色正常,皮肤无异常,饮食可,二便无异常,体重250±14g。造模后各组大鼠分笼饲养,各组大鼠在术后均出现一定程度的食欲不佳、少饮少排及体重下降,术后5～7天各组大鼠逐渐恢复正常。围手术期未见切口感染迹象,有2只大鼠于术后2周出现轻微肠胀气现象,疑为腹腔注射所致,行手法按摩后好转。各组大鼠均顺利存活至样品收集,无死亡。造模后4周,各检测结果可见:Rydell评分可见:Vehicle对照组和单纯手术对照组的硬膜外瘢痕粘连程度较Sal B治疗组重,可见严重的纤维组织增生,硬脊膜与术野瘢痕粘连严重,同时可见剧烈的炎症反应。Sal B治疗组的粘连情况较Vehicle对照组和单纯手术对照组明显减轻,局部可见松散状瘢痕组织,硬脊膜偶可见薄膜样粘连,粘连不紧密,可顺利将硬膜进行分离。羟脯氨酸检测结果提示:Vehicle对照组羟脯氨酸含量为(50.34±4.19)mg,单纯手术对照组羟脯氨酸含量为(53.59±3.27)mg,Sal B治疗组羟脯氨酸含量为(31.54±5.06)mg。同单纯手术对照组相比,Vehicle对照组羟脯氨.酸含量无显著差异(P>0.05),SalB治疗组羟脯氨酸含量显著降低(P<0.05)。马松三染色结果可见:L1椎体的石蜡切片马松三染色结果提示:胶原纤维呈蓝色,骨组织、肌纤维呈红色,胞核呈蓝褐色。Vehicle对照组和单纯手术对照组可见致密胶原沉积,硬膜外瘢痕组织与硬膜粘连紧密;Sal B治疗组可见胶原纤维散在存在,硬膜与硬膜外瘢痕组织无明显粘连。各组样品的切片经VEGF免疫组化染色后行光密度半定量结果提示:Sal B治疗组VEGF半定量结果为12.31±6.42、Vehicle对照组VEGF半定量结果为50.27±4.39、单纯手术对照组VEGF半定量结果为52.04±3.28,其中Vehicle对照组相较单纯手术对照组,VEGF表达无显著性差异(P>0.05),Sal B治疗组相较单纯手术对照组及Vehicle对照组,VEGF表达显著降低(P<0.05)。各组样品的切片经HE染色后可见,在椎板切除范围中,Vehicle对照组和单纯手术对照组可见较为致密的成纤维细胞和炎性细胞排布,密度分级多为3级;Sal B治疗组可见较低密度的成纤维细胞和炎性细胞排布,密度分级多为1级。从每组动物中以随机原则抽选出5只行炎性因子RT-PCR检测,结果提示:IL-6方面,相较单纯手术对照组,Vehicle对照组的IL-6表达无显著差异(P>0.05),SalB治疗组IL-6表达显著降低(P<0.05)。TGF-β1方面,相较单纯手术对照组,Vehicle对照组的TGF-β1表达无显著差异(P>0.05),Sal B治疗组TGF-β1的表达显著降低(P<0.05)。第二部分丹酚酸B预防大鼠椎板切除术后硬膜外粘连的剂量研究。在本部分研究中,40只Wistar大鼠随机分为Sal B(10mg/kg)组、Sal B(30mg/kg)组、Sal B(50mg/kg)组、对照组(生理盐水组),每组10只。将丹酚酸B溶于生理盐水中分别制备成浓度为2.5mg/ml、7.5mg/ml及12.5mg/ml的Sal B盐水溶液,充分震荡使其溶解。动物造模同上,给药治疗方式同上。造模8周后,每组动物均行Rydell评分宏观评估;从每组动物中以随机原则抽选出5只,行过量麻醉致死后,沿原手术切口进入,准确定位并完整暴露L1节段椎体,以生理盐水及10%PFA溶液灌注固定后,将L1椎体整体取下浸入至脱钙试剂液中,待脱钙满意后行组织学染色观察;造模8周后,从每组动物中以随机原则抽选出5只,行过量麻醉致死后,沿原手术切口进入,以尖刀/剪刀剪取收集硬膜外瘢痕组织,行VEGF的Western Blot检测;采用SPSS 16.0软件包(SPSS Incorporation,Chicago,IL,US)进行统计学分析,所得量化数据采用重复量测变异数分析,采用q检验进行组间数据的比较,以P<0.05定义为差异有统计学意义。造模后各组大鼠分笼饲养,各组大鼠在术后均出现一定程度的食欲不佳、少饮少排及体重下降,术后5～7天各组大鼠逐渐恢复正常。术后第4天有三只大鼠有血尿迹象,疑为手术创伤所致,未行特殊处理两天后好转。各组大鼠均顺利存活至样品收集,无死亡。造模8周后,各检测指标结果如下:大鼠硬膜外瘢痕粘连情况Rydell评分可见:对照组和Sal B(10mg/kg)组的硬膜外瘢痕粘连程度较重,可见严重的纤维组织增生,硬脊膜与术野瘢痕粘连严重,同时可见剧烈的炎症反应。SalB(30mg/kg)组和SalB(50mg/kg)组的粘连情况较轻,局部可见松散状瘢痕组织,硬脊膜偶可见薄膜样粘连,粘连不紧密,可顺利将硬膜进行分离。L1椎体的石蜡切片HE染色结果提示:骨组织、肌纤维呈红色,胞核呈蓝褐色。SalB 10mg/kg组和对照组可见硬膜外腔隙被瘢痕组织填充,并可见瘢痕组织挤压硬膜并形成致密粘连;Sal B 30mg/kg组与Sal B 50mg/kg组可见硬膜外腔隙中散在松散的瘢痕组织,瘢痕组织与硬膜未形成明显粘连。各组大鼠硬膜外瘢痕样品的切片经Vimentin免疫组化染色后行光密度半定量结果提示:Sal B 50mg/kg 组 VEGF 半定量结果为 352.39±89.355、Sal B 30mg/kg组VEGF半定量结果为489.77±87.61、Sal B 1Omg/kg组VEGF半定量结果为670.15±81.29、单纯手术对照组VEGF半定量结果为704.22±72.38,较对照组,Sal B 10mg/kg 组、Sal B 50mg/kg 组、Sal B 30mg/kg 组 Vimentin 表达显著降低(P<0.05)。其中,Sal B 50mg/kg 组 Vimentin 表达最低。各组大鼠硬膜外瘢痕样品的切片经HE染色后行单位视野血管计数结果提示:SalB50mg/kg组血管计数结果为6.13±2.45、SalB30mg/kg组单位视野内血管计数结果为6.48±2.81、Sal B 1 Omg/kg组单位视野内血管计数结果为8.15±2.76、单纯手术对照组单位视野内血管计数结果为10.23±2.55,较对照组,Sal B 10mg/kg组、SalB50mg/kg组、SalB30mg/kg组的单位视野内血管数量显著降低(P<0.05)。其中,SalB50mg/kg组血管计数最少。为了进一步验证血管表达情况,本研究对各组大鼠硬膜外瘢痕样品行VEGF的 Western Blot 检测,结果提示:较对照组,Sal B 10mg/kg 组、Sal B 50mg/kg组、Sal B 30mg/kg组的单位视野内血管数量显著降低(P<0.05)。其中,Sal B 50mg/kg组血管计数最少。本研究得出以下结论:(1)丹酚酸B在预防大鼠椎板切除术后硬膜外粘连形成方面具有显著效果;(2)丹酚酸B在预防大鼠椎板切除术后硬膜外粘连方面呈现剂量効应,本研究结果提示相较10mg/kg和30mg/kg的剂量,50mg/kg的丹酚酸B具有最佳预防效果,同时在研究期间,该剂量未致明显并发症;(3)丹酚酸B可通过抑制椎板切除术后胶原沉积、炎性反应活动、成纤维细胞增生、血管再生等过程达到预防目的。本研究为临床预防硬膜外粘连提供新的思路,为丹酚酸B抗纤维化的作用方面提供了新的理论依据,同时验证了在预防硬膜外瘢痕方面,50mg/kg的丹酚酸B相较10mg/kg和30mg/kg有更好的效果。