论文部分内容阅读
紫杉醇类化合物具有三环二萜的骨架结构,最初是从红豆杉等植物中分离获得。研究发现,紫杉醇是一种高效、低毒、应用广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物。但是由于受到原料来源和提取技术的制约,长期以来紫杉醇类药物在市场上处于供不应求的状态。近年来,应用植物内生真菌发酵大规模生产紫杉醇的技术取得了一定进展,为提高紫杉醇的产量开辟了新的途径,将会带来巨大的市场前景和经济效益。
近二十年来,拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis genus)真菌由于能产生大量的具有生物活性的天然产物,越来越引起人们的关注。但是目前的许多研究报道还只停留在宏观的水平,对其深入的分子层面的研究还很少。本实验室筛选到一株产紫杉醇的拟盘多毛孢属真菌NK-101,经过形态学和分子生物学上的分析鉴定,认为NK-101属于Pestalotiopsis malicola。目前本实验室已经对NK-101进行de novo全基因组测序,首次获得拟盘多毛孢属真菌的基因组信息,为全面研究NK-101菌株中关键基因功能奠定了基础。
本实验通过氨基酸序列比对,得到了NK-101菌株中与加拿大红豆杉(Taxuscanadensis)中苯丙氨酸氨基变位酶(phenylalanine aminomutase)(GenB ank:AAT47186.1)和美国短叶红豆杉(Taxus brevifolia)中紫杉二烯合成酶(taxadienesynthase)(GenBank: U48796)同源性较高的基因,将其分别命名为PAM基因和TS基因;通过农杆菌介导的丝状真菌转化的方法,将敲除质粒转入NK-101菌株中并将PAM基因和TS基因定向敲除,获得△pam和△ts菌株。通过对比野生型NK-101菌株和敲除菌株的菌落形态、产孢能力、菌丝生物量以及次级代谢产物合成能力等多种指标,推测PAM基因和TS基因的功能并做进一步的研究。
同时,将NK-101菌株中URA-3基因和ADE基因进行定向敲除,得到了尿嘧啶营养缺陷型菌株和腺嘌呤营养缺陷型菌株,为丝状真菌的转化提供了新的筛选标记。