论文部分内容阅读
目的:1.研究DEPDC7基因在肝癌细胞中差异性表达及其蛋白在细胞内的定位。2.探讨DEPDC7基因对肝癌细胞的增殖、凋亡和侵袭转移的影响。方法:1.常规培养正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Huh-7。2.用RT-PCR方法检测DEPDC7基因mRNA在肝癌细胞的差异表达。以GAPDH为内参,1.2%琼脂糖凝胶电泳,用GeneTool软件进行半定量分析。3.用Western Blot方法从蛋白质水平检测肝癌细胞的DEPDC7蛋白的表达,用GeneTool软件进行半定量分析。4.构建融合表达DEPDC7基因的pEGFP-C1-DEPDC7质粒载体。转染肝癌HepG2细胞、SMMC-7721细胞,然后用PI染色在激光共聚焦显微镜下检测DEPDC7蛋白在细胞内的定位。5.用MTT检测转染pIRES2-EGFP-DEPDC7质粒前后三株肝癌细胞的增殖情况,绘制细胞生长曲线。6.转染肝癌细胞非融合表达DEPDC7基因的pIRES2-EGFP-DEPDC7质粒,流式细胞仪和DNA ladder方法检测DEPDC7基因表达上调后肝癌细胞的细胞增殖率、凋亡。7.转染肝癌细胞pIRES2-EGFP-DEPDC7质粒载体,通过细胞Transwell试验研究DEPDC7基因对细胞的侵袭转移的影响。8.RT-PCR方法检测DEPDC7基因对侵袭相关基因表达的影响。结果:1.RT-PCR半定量分析,DEPDC7基因在肿瘤细胞的mRNA水平表达比正常肝细胞中表达显著降低,三株肝癌细胞两两之间比较,差异有统计意义（P<0.05）。2.Western Blot结果半定量分析,HL-7702与三株肝癌细胞在蛋白质水平表达差异有显著性（P<0.05）。三株肝癌细胞两两之间的表达水平比较也有显著差异,Huh-7中蛋白表达最低,有统计意义（P<0.05）。3.转染pEGFP-C1-DEPDC7质粒载体的肝癌细胞DEPDC7蛋白主要定位于细胞膜上,胞质内也可见。4.生长曲线图显示,肝癌细胞生长较快,在72h内达到对数生长期,转染pIRES2-EGFP-DEPDC7质粒后的肝癌细胞增殖较慢。5.上调DEPDC7基因的表达,细胞增殖率受抑制,但未见有细胞凋亡现象。6.上调DEPDC7基因的表达,对肿瘤的侵袭起抑制作用,并且能够使肿瘤侵袭相关的基质金属蛋白酶类基因的表达量发生变化。结论:1.DEPDC7基因在正常肝细胞中高表达,肝癌细胞中表达下调,其表达的蛋白主要定位于细胞膜上,胞质内也可见。2.上调DEPDC7基因表达后不引起细胞的凋亡,能抑制细胞增殖率和肝癌细胞的侵袭转移,MMP-9基因表达量降低,TIMP-1、TIMP-3基因表达量增高。