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聚合酶链反应(PCR)是当今分子生物学研究领域最重要的工具之一,在PCR反应中,耐热性DNA聚合酶的活性特点关系到PCR反应的特异性、高效性和忠实性。Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶,并以其耐高温、较高的特异性、灵敏度等优良特性被广泛应用在PCR扩增中。然而常规的Taq DNA聚合酶没有3’→5’核酸外切酶活性,即在PCR反应中缺乏校对活性,保真度较之高保真Pfu DNA聚合酶要低很多,且对长片段DNA模板的扩增效率也较低。因此,对Taq DNA聚合酶的改性研究成了当今PCR研究领域中的重点。论文旨在运用基因工程手段从基因水平改造Taq DNA聚合酶的原始表达基因,从而获得一种兼具高效性和保真性的新型DNA聚合酶Taq-omni DNA聚合酶。首先,运用基因工程手段将蛋白Sso7d融合到Taq DNA聚合酶中,Sso7d融合蛋白的表达可加快Taq DNA聚合酶在PCR中的延伸速率以及对PCR抑制剂的抵抗能力。并对重组体进行定点突变,改善Taq DNA聚合酶的特异性和PCR扩增长度。其次,IPTG诱导表达Taq-omni DNA聚合酶,用Ni2+-NTA纯化该酶,进行SDS-PAGE电泳并结合基因测序确定Taq-omni DNA聚合酶的分子量的大小。最后,检测了Taq-omni DNA聚合酶的部分特性,该酶分子量约为101KDa,耐热性极强,95℃,2h高温处理后活性仍能保留50%。PCR反应的最优缓冲体系是：50mmol/L Tris-HCl (pH8.2),4mmol/L MgCl2和0.02%Triton X-100。该酶在PCR中的扩增速率较高,扩增2.9Kb的DNA模板,Taq-omni DNA聚合酶只需要10s (Taq需要40s,Pfu需要80s),且特异性较好。在常规PCR条件下,成功扩增了长达5.37Kb的模板DNA。并能成功扩增土壤DNA、小鼠血清、76%的高GC含量的DNA等,且对PCR抑制剂表现出较高的抵抗力。因此,实验结果具有较广的参考价值。论文初步解决了耐热DNA聚合酶高效性与保真性间的矛盾,其研究方案及结果为耐热性DNA聚合酶的研究提供了一定的数据考证。