山羊促卵泡素(FSH)基因cDNA的克隆、序列分析与表达研究

来源 :扬州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cychenying2007
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利用RT—PCR技术从山羊脑垂体RNA中成功扩增出促卵泡素(FSH)α和β亚单位cDNA。山羊FSHα亚单位cDNA的阅读框由363个bp组成,编码由120个氨基酸组成的多肽,前24个氨基酸为潜在的信号肽序列,成熟肽由96个氨基酸组成,预测分子量为10.79kDa,其56和82位上存在两个潜在的N—糖基化位点。β亚单位cDNA的阅读框由390个bp组成,编码由130个氨基酸组成的多肽,前18个氨基酸为潜在的信号肽序列,成熟肽由111个氨基酸组成,预测分子量为12.53kDa,其7和24位上存在两个N—糖基化位点。山羊FSHα亚单位与已发表的绵羊、牛、水牛的氨基酸序列同源性分别为100%、97.5%和98.3%,山羊FSH β亚单位与已发表的绵羊、牛和猪的氨基酸序列同源性分别为97.7%、93.1%和93.1%。 将克隆于pGEM-T Easy质粒中的FSH β亚单位基因片段通过PCR扩增获得去信号肽的cDNA阅读框,再将此插入到原核表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S—转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pGEX-6p-1-FSH β。将此重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,通过对重组大肠杆菌菌体的超声波裂解物的SDS—PAGE电泳分析及Western-blot鉴定,结果表明重组菌能满意表达融合蛋白形式的FSH β,即FSH β蛋白与谷胱甘肽S—转移酶相连组成的蛋白质,分子量约为41kDa,与预期大小一致,电泳扫描净灰度达28%。 用粗制的GST-FSH β融合蛋白包涵体作为免疫原免疫雌性ICR小鼠,观察免疫应答反应及其产生的生物学效应。结果表明,大肠杆菌表达的GST-FSH β融合蛋白免疫小鼠制备了针对FSH β的特异性多克隆抗体。免疫组小鼠子宫的生长受到抑制,子宫重与对照组存在显著差异(p<0.05)。由此表明,针对FSH β的多抗与小鼠体内FSH发生了免疫中和效应。 本实验研究结果,不仅揭示了山羊FSH的分子结构,而且为山羊FSH基因工程产品的研制,及开展山羊FSH免疫与应用研究奠定了基础。
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