目的明确作为肿瘤治疗载体的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在肿瘤微环境中是否受到其中的细胞因子、信号分子及细胞间相互作用的影响而自身发生肿瘤转化,转化的细胞在裸鼠体内是否能够形成肿瘤,进而为MSCs进行修饰以规避其瘤化的危险性,使其更加安全地应用于临床提供前期实验基础。材料与方法1.细胞培养:取Wistar大鼠的股骨和胫骨骨髓,贴壁筛选法体外分离、培养、扩增MSCs;C6胶质瘤细胞采用与MSCs相同的培养基进行培养。2.实验分组:本实验分体外实验和体内实验,体外实验设为两组即对照组(单独培养的MSCs),实验组(间接共培养组:transwell插入式培养皿结合6孔板构建MSCs和C6细胞共培养体系;直接共培养组:GFP腺病毒标记MSCs后加入C6细胞共同培养);体内实验分三组:阴性对照组(体外单独培养的MSCs注入裸鼠体内),阳性对照组(C6胶质瘤细胞注入裸鼠体内),实验组(与C6胶质瘤细胞非接触共培养后的MSCs注入裸鼠体内)。3.实验方法:1)共培养过程中倒置相差显微镜下连续观察细胞形态的变化。2)根据细胞周期的改变及核干细胞因子(necleostemin,NS)的表达变化检测细胞增值力的改变。3)采用实时荧光定量PCR检测实验组和对照组细胞中抑癌基因p53 mRNA和癌基因mdm2 mRNA的变化。4)免疫荧光法和westernblot分析突变型p53蛋白和mdm2蛋白的表达变化。5)常规染色体及G显带核型分析方法检测培养后两组细胞的染色体的改变。6)免疫荧光法检测神经胶质细胞及其肿瘤特异的胶质纤维酸蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)在细胞中的定位及表达。7)与C6胶质瘤细胞体外共培养发生转化的MSCs植入裸鼠皮下,连续观察其裸鼠形体的变化,4周、8周后取材,组织病理检测细胞的存活转化及肿瘤形成,免疫组化检测形成的组织中GFAP蛋白的表达情况。结果1)利用贴壁筛选法获得的MSCs的纯度较高,第4代的MSCs形态均一,细胞扁平,成纤维细胞样,分布均匀,排列有序。与C6胶质瘤细胞共培养7d后,实验组细胞形态发生显著变化,胞质向胞核周围收缩,细胞变细变长,胞核变小,类似于神经胶质瘤细胞样的形状。2)流式细胞周期检测示实验组G1期细胞比例降低,S期比例升高,两组比较无统计意义(p>0.05);NS蛋白的表达两组间无显著差异。3)定量PCR结果示实验组p53 mRNA表达降低,是对照组的0.24倍(p<0.01),而mdm2 mRNA表达升高,是对照组的3.18倍(p<0.01);免疫荧光及Westernblot结果示实验组部分细胞中表达突变型p53蛋白,而对照组无该蛋白表达,实验组mdm2癌蛋白高度扩增,与对照组比较p<0.05。4)染色体核型分析结果为对照组细胞染色体众数是42,实验组细胞染色体变动于38到42条之间,其中41条染色体所占比例为33%,说明共培养后实验组细胞染色体数目出现非整倍体的改变,G显带未见明显的核型改变。5)免疫荧光结果示实验组几乎所有细胞表达GFAP蛋白,而对照组仅为13%,两组比较p<0.05。6)以注射的方式将体外培养已转化的MSCs植入裸鼠皮下,4-8周后大体标本可见实验组植入区新生物形成,取新生组织HE染色见组织由多形性未分化细胞组成,细胞聚集明显,排列紊乱,胞核大并见多倍体核及多形核,组织边界消失,向临近的肌肉侵润,组织内部见大量的血管增生及中心片状坏死;免疫组化提示此组织表达胶质瘤特异的GFAP蛋白。结论体外胶质瘤微环境中培养的MSCs可以获得肿瘤细胞的相关生物学特性,并转化成胶质瘤样细胞。体外胶质瘤微环境中培养发生转化的MSCs植入裸鼠体内能够形成肿瘤。