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目的：胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS）是参与脱氧核糖核酸生物合成的胸腺嘧啶核苷酸从头合成过程唯一的限速酶，TS活性的抑制将直接影响DNA的合成和细胞的分裂增值，因此是化疗中一个理想的靶点。洛拉曲克是新近研究出的非经典类叶酸类似物，在Ⅱ期临床实验中证实其对多种肿瘤有良好的治疗效果。尽管目前对洛拉曲克作用机理的研究提示其主要作用于TS，但尚无对洛拉曲克作用后TSmRNA和蛋白质水平的动态变化规律进行研究，因此本文的目的在于：证实洛拉曲克在不同细胞中的跨膜转运是否存在差异，研究TSmRNA和蛋白质水平在洛拉曲克作用后的动态变化规律，以探讨洛拉曲克抗增值作用机理的多样性。 方法：以大鼠胶质瘤C6细胞、小鼠腹水瘤肉瘤SRS—82细胞、人大肠癌LoVo细胞、人正常肝脏Lo2细胞为实验细胞系。用MTT法确定4株细胞对洛拉曲克的敏感性。在细胞膜水平，以上述三种肿瘤细胞在不同浓度的洛拉曲克处理不同时间后以高效液相色谱法测定细胞内药物浓度，比较不同肿瘤细胞中洛拉曲克跨膜转运有无差异。在TSmRNA水平，上述4种细胞在用不同剂量的洛拉曲克处理不同的时间后提取总RNA，以RT-PCR法检测TS和β—actin的mRNA，以TS／β—actin的比率反应TS mRNA的动态变化。在蛋白质水平，以不同浓度的洛拉曲克处理人LoVo细胞和Lo2细胞不同的时间，分别以流式细胞法、激光共聚焦显微镜法、Western Blot法检测TS蛋白表达水平的动态变化。 结果：（1）MTT结果显示：C6、SRS-82、Lovo、Lo2细胞的IC50值分别为0.37±0.09 μmol·1-1、2.50±0.42 μmol·1-1、5.10±0.78 μmol·1-1、54.90±4.70 μmol·1-1。C6、SRS-82、Lovo、Lo2细胞的IC90值为0.60±0.11 μmol·1-1、4.90±0.42 μmol·1-1、10.46±1.51 μmol·1-1、第一军医大学博士研究生学位论文79 .10士5.80 p mol·l一，.结果表明与正常细胞LoZ相比，兰株肿瘤细胞对洛拉曲克敏感。三株肿瘤细胞中又以c6细胞对洛拉曲克最为敏感，SRS一82细胞和Lov。细胞的I侃值分别比c6细胞的I侃值高6.8倍和13.8‘倍，有统计学差异（P<0 .05）（2）在高效液相色谱分析中，洛拉曲克在所有三株肿瘤细胞中的跨膜转运在“质如上相似，细胞内药物浓度在5分钟内即达到稳态浓度。在O到40林mol·l一，的范围内，用不同浓度的洛拉曲克处理细胞10分钟后细胞内药物浓度变化的剂量曲线三株细胞的细胞内、外的药物浓度均存在线性关系。C6细胞的洛拉曲克稳态细胞内浓度显著高于其它两株细胞（P<0.05），分别是Lov。细胞和SRS一82细胞的4. 96和·4;52倍。在Lovo细胞和SRs一82细胞之间，其洛拉曲克稳态细胞内浓度无统计学差异。（3） RT‘PcR结果显示:在4种细胞的时间曲线中，除正常细胞LoZ卜无明显变化外，TS/p一ac tin比值与对照相比均有一定的变化趋势，有趣的是，三种肿瘤细胞的变化趋势各不相同弘，一是升高后呈平合形，二是升高后又降低呈峰形，三是持续升高。在剂盆曲线中，.除Lo物，细胞变化不明显以外，其余三种细胞表现相似，即浓度在I侃值附近或比其低浓度的洛拉曲克可使TS/p一actin比值升高，但更高浓度则使比值降低，.表现出细胞毒性。对PCR产物进行测序表明确为、Ts产物。 （4）利用流式细胞仪检测TS蛋白表达，结果显示，在LoVo细胞的时间组中，洛拉曲克处理后的Lov。细胞朽蛋白的表达与对照相比呈持续升高的趋势，与LOVO细胞TsmRNA变化的趋势相似。在剂量组中，TS蛋白表达的变化与Lov。细胞TSmRNA变化的趋势相似，呈峰形。在LoZ细胞的时间组中，洛拉曲克处理后的LoZ细胞TS蛋白的表达与对照相比先降低，24小时后TS蛋白表达水平逐渐回升，但至60小时尚未恢复至对照水平.在剂量组中，在低于I侃值的三个剂量点TS蛋白水平降低，程度相似，高于ICso值的两个剂量处理后Ts水平持续下降。（5）利用激光共聚焦显微镜检测TS蛋白表达，结果显示，在LoVo细胞和LoZ细胞的时间组和剂 4第一军医大学博士研究生学位论文量组中，其趋势均与流式细胞检测结果趋势类似，但变化幅度较小。（6）采用western Blot确定上面两种蛋白检测结果何者更为准确.结果倾向于用流式细胞仪检测的结果更为准确。结论:（1）在洛拉曲克作用下，细胞TSmRNA和蛋白质水平的动态变化规律在不同的细胞株中表现不同。（2）尽管洛拉曲克为脂溶性药物，但相同浓度下不同细胞株内的稳态药物浓度并不相同，这一跨膜转运机制上的细胞株间差异可能部分参与了细胞对洛拉曲克不同的敏感性的形成。（3）尽管理论上洛拉曲克作用并不影响TSmRNA水平，但本实验证明TSmRNA水平在不同形式的药物作用下有一定的动态变化，提示洛拉曲克药理作用的复杂性。(的低于ICg。值的洛拉曲克作用可使存活的Lovo细胞TS蛋白水平上调，这可能是细胞耐药性形成的一种机制，同时高于IC90值的洛拉曲克作用可使存活的LoVo细胞TS蛋白水平上调幅度减小。结合肿瘤细胞与正常细胞敏感性的显著差异，可以通过适当提高药物浓度 (?