论文部分内容阅读
低质量蛋白消化利用率不高导致蛋白质供应不足和环境氮污染已成为当今畜牧业的两大主要问题。羽毛巾粗蛋白含量超过80%,含有大量动物需要的氨基酸,但是动物消化系统对羽毛的消化利用率非常低。本研究旨在探讨从Thermonospora fusca YX中分离的一种稳定的碱性嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA消化羽毛的能力与机理,对tfpA基因进行改造,筛选适合TfpA的表达系统。研究内容包括以下三个方面：研究一TfpA酶降解羽毛能力及机理的探讨在BMMY培养基中诱导X33酵母和重组X33-pPICTFP酵母表达,分别取上清液消化羽毛。结果表明,重组X33-pPICTFP酵母表达上清液在NaN3的抑菌作用下能消化羽毛。为进一步研究羽毛被降解的作用机制,实验对不同浓度r-TfpA的还原酶活性进行检测,结果发现r-TfpA不具有还原酶活性。同时研究发现10mmol/L PMSF能抑制r-TfpA的82.7%蛋白酶活性,亦能抑制r-TfpA消化羽毛。在重组TfpA降解羽毛粉的实验中添加10mmol/L Na2SO3,通过测定8h、24h、48h上清液中的可溶性蛋白质生成量和游离氨基酸相对生成量发现,在三个时间点上添加Na2SO3组蛋白质生成量较之对照组都有所提高,但差异都不显著(P>0.05),8h时添加Na2SO3组氨基酸生成量较之对照组提高了26.1%,差异显著(P<0.05),24h、48h两个时间点反而降低了3.9%、1.2%,但差异都不显著(P>0.05)。以上结果表明,r-TfpA能降解羽毛,同时发现r-TfpA并不具有还原酶活性,其降解能力与其蛋白酶活性有关；还原剂Na2SO3能够加速重组TfpA降解羽毛粉,但不能提高重组TfpA降解羽毛粉的能力。研究二定点突变tfpA基因的在毕赤酵母中的表达根据TfpA分子结构特点,利用分子生物学技术,设计11个定点突变,并以pPICTFP质粒为模板,进行PCR扩增得到突变pPICTFP质粒,并转化到毕赤酵母X33中,对重组酵母X33-pPICTFP突变进行诱导表达,纯化及Wetern blot分析。结果发现,在诱导上清液中,M14(R220Q)酶活性比WT高18.8%,而M9(G192P)、 M15(D219N)都降低了,其他8个重组突变酵母则没有表现出蛋白酶活性。分别对表达上清进行纯化,12%SDS-PAGE电泳结果显示,M9、M14和M15蛋白分子量大小都为21.7kDa,与WT在毕赤酵母中表达大小一致,Western blot验证为TfpA蛋白。测定蛋白酶比活力发现,M9、M14和M15酶比活力分别提高到WT的235%、129%和231%。以上结果表明,实验获得了TfpA在毕赤酵母中高表达量菌株X33-pPICTFP-M14,和高酶比活力突变蛋白酶M9、M14和M15。研究三tfpA基因在酿酒酵母中的表达分别诱导酿酒酵母INVSc1、重组INVSc1-pYETFP、毕赤酵母X33和重组X33-pPICTFP,分析其生长曲线及产酶趋势。结果发现,酿酒酵母表达TfPA第4d收集上清的蛋白酶活性为246.5U/mL,明显高于同样条件下毕赤酵母表达TfPA第4d收集上清的160U/mL。在YPG培养基中诱导表达重组INVSc1-pYETFP,将发酵液进行离心,取上清进行生物膜浓缩、硫酸铵沉淀,采用分子筛G-50进行纯化和Western blot分析。SDS-PAGE电泳结果显示,蛋白分子量大小为21.7kDa,与WT在毕赤酵母中表达大小一致,Western blot验证为TfpA蛋白。测定r-TfpA蛋白酶比活力为5915U/mg,为毕赤酵母表达纯化r-TfpA的2.4倍。以上结果表明,较之毕赤酵母系统,在酿酒酵母系统中表达TfpA更具有优越性。综上所述,本研究首次揭示了TfpA酶对羽毛的降解能力,并进一步对其降解机制进行了研究。同时通过对TfpA活性中心的分子改造,获得了高表达量的重组TfpA菌株和高酶比活力的TfpA突变酶。此外,本研究通过TfpA在酿酒酵母和毕赤酵母中表达的比较,发现酿酒酵母系统提高了TfpA表达量和酶比活力。