各种原因引起的小肠上皮形态和功能受损，导致严重的消化吸收不良；以及迁延不愈的肠瘘和Crohn’s病是内外科临床面临的棘手问题。小肠移植，全胃肠外营养，应用生长激素等传统的治疗方法有一定疗效，但存在供体匮乏，免疫排斥，高额的费用，疗效欠佳等方面的限制。新的治疗途径正在探索中。 自从1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系，掀起了全球范围内的干细胞研究热潮。胚胎干细胞(ESC)是一群未分化细胞，可无限增殖并分化为机体的几乎所有的细胞类型，构建各种组织、器官。所以干细胞替代疗法有望成为组织和器官的损伤或功能衰竭的一种有应用前景的治疗方法。 目前已经证实，胚胎干细胞可在体外被定向诱导分化为神经细胞、心肌细胞、造血细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等多种细胞类型。但是体外诱导胚胎干细胞向肠上皮细胞定向分化的研究进展仍相当缓慢。另外，由于对胚胎发育过程中基因激活与沉默的机制以及胚层，组织和细胞间的信息网络知之甚少，因此，如何建立优化的体外诱导体系使ESC定向分化，如何获得大量纯化、稳定和成熟的目的细胞，仍是干细胞研究的难点。 在特定的体内外环境下胚胎干细胞分化过程中，必然先经过若干前体细胞阶段。本研究拟以小肠上皮发育生物学的研究进展为外源因子的选择依据，按照小肠上皮干细胞发育、生长与所在的环境密切相关的规律，对体外诱导胚胎干细胞向小肠上皮细胞定向分化的研究领域进行初步探索。在表皮生长因子(EGF)、GlutaMAX-Ⅰ及胰岛素等为分化诱导因子的培养液中增加小肠间质细胞培养上清，提高诱导的效率和准确性，从而建立有效的诱导ESC定向分化为干细胞的体外培养体系。 目的 本研究按照ESC定向分化的理论和技术，探讨体外诱导鼠ESC分化为小肠上皮细胞的可行性，分析小肠间质细胞的培养上清液对ESC向小肠上皮细胞分化的影响，为大量获取用于细胞移植的小肠上皮细胞奠定一定的实验基础。 方法 1体外小鼠小肠上皮细胞及间质细胞的分离和原代培养，进行细胞形态学观察，并根据培养细胞形态特征，以及免疫细胞化学染色和免疫荧光染色分别检测CK18蛋白和Vimentin蛋白的表达、AKP染色定性鉴定原代培养细胞。用含10％胎牛血清的DMEM培养小肠间质细胞，同时收集小肠间质细胞原代培养上清液，并以原代小肠上皮细胞作为实验阳性对照(原代组)。 2首先体外培养、扩增小鼠ESC细胞系E14；将小鼠ESC细胞系E14在去除重组鼠白血病抑制因子后用悬滴法培养，使其形成拟胚体；然后分别用加入小肠间质细胞原代培养上清液(上清组)和未加小肠间质细胞原代培养上清液(非上清组)(两组培养液中均含20％胎牛血清、2mmol/LGlutaMAX-Ⅰ、20ng/mlEGF、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2μg/ml胰岛素)分别体外培养16～21d。对不同诱导方案下分化的细胞行细胞形态学观察、AKP染色、免疫荧光染色检测CK18的表达、RT-PCR检测Msi-1，Hes-1，Cdx2，CK19的mRNA转录水平。此外，把不同方案诱导分化的细胞接种到BABL/c裸鼠皮下，观察其在体内形成小肠黏膜细胞能力的。 结果 1倒置显微镜下观察原代培养的小肠上皮细胞，24～48h可见贴壁；4～6d形成一群群的细胞集落；10～12d细胞汇合成片。细胞为圆形、多角形单层生长，呈“铺路石样”。细胞浆丰富，核为圆形或卵圆形，含1～2个核仁，核周可见许多小空泡。免疫组化染色后，可见胞浆内出现棕色颗粒，表达CK18蛋白，阴性对照细胞组细胞未见被染色。以改良Kaplow氏法显示AKP，细胞表面呈暗黑或灰黑色阳性反应。另免疫荧光染色显示原代小肠间质细胞的胞浆有Vimentin的表达。 2经不同诱导的拟胚体，在1W左右的时间都可见上皮样细胞向周围生长。2W左右上清组的大部分分化细胞为上皮样细胞，呈现较好的均质性，但是非上清组的分化细胞中还存在较多的成纤维细胞样细胞等杂细胞生长。继续观察到3W以后，细胞开始死亡、脱落。免疫荧光染色显示两组均有大量CK18的表达。AKP染色显示上清组细胞中AKP染色阳性的细胞(26.9±2.5％)较非上清组(1.2±0.9％)高(P＜0.05)。RT-PCR半定量结果显示上清组和非上清组的Msi-1和Hes-1mRNA的表达无差别(P＞0.05)，但两组Msi-1和Hes-1mRNA的表达均高于原代组(P＜0.05)；非上清组Cdx2mRNA的表达低于上清组和原代组(P＜0.05)，上清组的Cdx2mRNA的表达低于原代组(P＜0.05)；原代组与非上清组和上清组的CK19mRNA的表达无差别(P＞0.01)，而非上清组CK19mRNA的表达低于上清组(P＜0.01)。对裸鼠皮下肿物组织切片HE染色后观察，上清组可见较多的管腔，管腔内面可见到明显的绒毛样结构，有大量的柱状上皮细胞和杯状上皮细胞；非上清组管腔结构较少，组织中可见多种细胞，如软骨细胞、骨细胞、肌细胞、腺上皮细胞等。肿物组织切片AKP染色后观察，上清组可见管腔内面棕黑色线样沉淀，为AKP阳性表现；这种现象在非上清组相对少见。 结论 1应用中性蛋白酶Ⅰ和粗胶原酶Ⅺ消化可获比较纯化的上皮细胞。 2应用胶原酶Ⅺ(胶原酶Ⅰ)消化后再通过组织块培养法，并通过胰酶的差异消化最终可以获得较纯化的小肠间质细胞。 3诱导培养体系中加入小肠间质细胞的培养上清液对在体外定向诱导ESC分化为小肠上皮样细胞有一定的促进作用。