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[目 的]NKX2-5是调控胚胎期心脏发育的关键转录因子,同时在维持心脏正常的收缩功能和电生理活动中也起重要作用,其功能异常导致心脏结构和功能异常。目前NKX2-5调控心脏发育及心肌细胞分化与功能的具体分子机制尚待剖析,本课题旨在研究NKX2-5调控心脏发育及心肌细胞分化与功能的分子机制以及NKX2-5基因突变与人类先天性房间隔缺损发生之间的相关性。[方 法](1)提取30例ASD患者和30例健康对照者的外周血DNA,以Illumina测序技术对NKX2-5基因全长进行测序。(2)构建shRNA慢病毒载体,敲低大鼠心肌细胞系H9c2的Nkx2-5,对H9c2细胞的增殖能力、迁移能力和心肌细胞分化发育相关基因(Actn1,Tnnt2,Tbx5,Gata4,Hand2,Fgf10)的表达进行检测。(3)RNA-seq技术分析敲低Nkx2-5后H9c2细胞的基因表达谱改变,生物信息学分析差异表达基因富集到的信号通路,寻找Nkx2-5调控的关键基因及信号通路。(4)qRT-PCR对差异表达基因进行验证,western blot技术对富集到的信号通路的活化状态进行检测。(5)TGF-β信号通路抑制剂和MAPK信号通路抑制剂分别抑制H9c2细胞的TGF-β信号通路和MAPK信号通路,检测H9c2细胞的增殖能力及心肌细胞分化和功能相关基因的表达。[结 果](1)在ASD患者的NKX2-5中检测到单核苷酸变异,变异位点包括rs2277923,rs3131915,173233524,173233520,173233516 和 rs703752,变异频率分别为83.3%,13.3%,70%,26.7%,3.3%和 10%。在健康对照者的 NKX2-5 中检测到单核苷酸位点变异,变异位点包括rs2277923,rs3131915,173233524,173233520,173233516 和 rs703752,变异频率分别为 80%,13.3%,80%,16.7%,10%和 13.3%。在ASD患者组和健康对照组中,上述单核苷酸位点变异的OR值(95%置信期间)分别为 1.25(0.34-4.64),1,0.58(0.18-1.91),1.82(0.52-6.32),0.31(0.03-2.84)和0.72(0.15-3.57)。(2)敲低H9c2细胞的Nkx2-5导致细胞增殖减低、细胞迁移增强、心肌细胞分化标记物Tnnt2、细胞收缩相关蛋白Actn1和细胞缝隙连接蛋白Gja1的表达减低,同时也导致心脏发育相关基因Tbx5,Gata4,Hand2的表达减低。(3)RNA-seq结果提示敲低Nkx2-5导致下游基因的表达改变,GO富集分析提示差异表达基因富集于细胞外空间、细胞外基质、钙离子依赖的磷脂结合、钙离子依赖性胞吐作用的调节、心脏内皮间质化、心脏HIS束发育和心肌细胞增殖等生物学过程,pathway富集分析提示差异表达基因富集于TGF-β信号通路、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心律失常性右心室心肌病相关通路。(4)RNA-seq结果提示敲低Nkx2-5导致下游miRNAs的表达改变,通过靶基因预测后再对这些差异表达的miRNAs的靶基因进行GO富集分析,结果提示差异表达的miRNAs的靶基因富集于多种生物学过程,包括基因的转录调节、氧化还原反应、细胞信号转导、细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖、蛋白磷酸化、蛋白水解、细胞内信号转导、蛋白泛素、基因表达,所发挥的功能包括蛋白结合、金属离子结合、ATP结合、同源蛋白结合、同源结构域蛋白二聚体活性、DNA结合、RNA结合、锌离子结合、钙离子结合。pathway富集分析提示差异表达的miRNAs的靶基因富集于MAPK信号通路,FoxO信号通路,mTOR信号通路,p53信号通路,Ras s信号通路和Sphingolipid信号通路。(5)qRT-PCR结果提示敲低Nkx2-5导致与细胞增殖、迁移及心肌细胞分化与功能相关的关键基因即TGF-β2,Id2,Wt1,Cacna1g,Heyl,Tnnt2,Actn1,Gja1,Tbx5,Gata4,Myl2,Hand2,Fgf10和miRNA1的表达改变,Western blot结果提示敲低Nkx2-5导致MAPK信号通路抑制。(6)抑制TGF-β信号通路导致H9c2细胞增殖减低,抑制TGF-β信号通路导致Tnnt2表达减低,Actn1,Gjal,Gata4,Hand2,Id2,Wnt4和Xdh表达增加。(7)抑制MAPK信号通路导致H9c2细胞增殖减低,抑制MAPK信号通路导致Tnnt2,Wnt4 和 Lrp2 表达增加,Actn1,Gjal,Tbx5,Hand2,Wt1,Heyl,Xdh,Cacna1g,Syt1,Pou5f1和Xdh 表达减低。[结 论]1.ASD患者的NKX2-5中存在有单核苷酸位点变异,这些位点变异可能与ASD的发生相关。2.Nkx2-5促进大鼠心肌细胞H9c2增殖,抑制细胞迁移,调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。3.TGF-β信号通路激活可促进大鼠心肌细胞H9c2增殖并调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。4.MAPK信号通路激活可促进大鼠心肌细胞H9c2增殖并调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。5.转录因子 NKX2-5 可能通过TGF-β2,Id2,Wt1,Cacna1g,Heyl,Tnnt2,Actn1,Gja1,Tbx5,Gata4,Myl2,Hand2,Fgf10,miRNA1,TGF-β信号通路和 MAPK信号通路调控心肌细胞的增殖、迁移、分化及功能。