背景：弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)诊断一直是神经科学、法医病理学实践和研究的一项重、难点课题,尤其是对伤后迅速死亡的DAI案例,其早期发现、检测更缺乏客观、准确的方法。以往的检测方法主要在亚细胞水平检测轴索损伤后形态学改变和某些生物标记物(biomarkers)表达改变,主要通过应用银染法、免疫组织化学染色方法检测轴索损伤。这些方法在诊断DAI时均存在缺陷,如银染法无法发现急性期轴索损伤,而各种免疫组织化学的生物标记物则无法区别原发性和继发性的轴索断裂,同时这些标记物严重依赖于轴索损伤后形态改变,即在轴索出现明显形态改变的时间窗时才具有诊断价值。轴索损伤后,髓鞘、轴膜、轴索内微结构甚至轴索间隙的改变均可以引起损伤局部区域水分子弥散大小、方向等弥散特征改变,而且随着损伤时间延长,水分子弥散也可能出现一定的变化规律。本研究突破传统的形态学研究思路,应用DTI技术对DAI后白质感兴趣区(regions of interest, ROIs)的水分子弥散特征进行研究。联合应用DTI水分子弥散参数及免疫组织化学指标等生物标记物检测DAI,弥补单个生物标记物诊断轴索损伤的缺陷,寻找诊断轴索损伤最佳的或联合的诊断生物标记物体系,将DAI诊断方法引入到分子水平,消除因依赖轴索形态而引起DAI诊断的局限。同时,在前期动物实验的基础上,对比研究离体TBI人脑标本DTI弥散参数及免疫组织化学结果,初步探讨DTI技术在法医病理检案中的应用价值。本研究属于法医病理学、神经科学与医学影像学的交叉性创新研究。目的：1.检测大鼠DAI急性期3-72h白质感兴趣区DTI各弥散参数改变特征,分析弥散参数改变时间规律。2.观察DAI大鼠脑组织β-APP免疫组织化学染色特征,定量分析相应ROIs β-APP单位面积阳性染色轴索数和阳性染色轴索面积百分比变化规律。3.观察DAI大鼠脑组织NF-L免疫组织化学染色特征,定量分析相应ROIs平均光密度和积分光密度变化规律。4.建立DAI大鼠DTI弥散参数和β-APP或NF-L免疫组织化学观察指标的相关性,评估DTI技术在DAI中的诊断价值。5.探讨离体TBI入脑DTI弥散参数的改变特征及其与p-APP免疫组织化学染色的对应关系,初步探讨DTI对人脑TBI轴索损伤的诊断价值。材料和方法：实验材料及仪器SD雄性健康大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部及武汉大学医学部动物实验中心)；小动物磁共振成像仪(7T/20cm Bruker Biospec scanner,德国)；小动物磁共振成像仪工作站图像分析软件(paravision5.0, Bruker Biospec,德国)；Signa EXCITE1.5T HDECHO超导型磁共振扫描仪(GE公司,美国)；恒温冰冻切片机(CM3050S,Leica,德国)；高级研究型显微镜(Nikon Eclipse90i,日本)；尼康显微镜图像分析系统(NIS Element BR3.1,日本);实验室超纯水机(AJY-660-U,上海艾科浦公司)；电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；恒温磁力搅拌器(金坛市科兴仪器厂)；低温高速离心机(Eppendorf,德国)；酸度计(PHS-3D,中国上海雷磁仪器厂)；烤片机(KPJ-1A,天津天利航空机电有限公司)；单克隆兔抗β-APP (Y188, IgG, Abcam,英国)；单克隆鼠抗NF-L(NR4, IgM, Sigma,美国);单克隆鼠抗β-APP (M066-3, IgG, MBL,日本)；生物素化羊抗兔IgG、羊抗鼠IgM、羊抗鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司,中国);VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Loboratories,美国)；三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane, Tris)(Dow chemical,美国)；多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)(Sigma公司,美国)；磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O),磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O),水合氯醛(chloral hydrate),甘油(glycerol),30%H2O2和TritonX-100(国药集团化学试剂有限公司,中国)；乙醇、二甲苯、氨水、盐酸、中性树脂(上海化学试剂有限公司试剂一厂)；主要试剂配制方法：1.10×TBS:60.5g Tris+90g NaCl加800ml双蒸水,加HC1调PH值至7.6,加双蒸水定容至1000ml；2.4%多聚甲醛溶液：20g多聚甲醛+5.75g Na2HPO4.12H2O+500ml双蒸水,加热搅拌至充分溶解后加入1.31g NaH2PO4.2H2O,溶解、冷却后置于4℃冰箱冷藏备用；3.0.9%生理盐水：2.7g NaCl加入300m1双蒸水,溶解后置于4℃冰箱冷藏备用；4.10%水合氯醛：10g水合氯醛加双蒸水定容至1000ml；5.30%蔗糖TBS：60g蔗糖加1×TBS定容至200ml,充分溶解后加入5%NaN32.0ml,溶解后置于4℃冰箱冷藏备用；6.抗体稀释液(Supermix):0.25g明胶+500μl TritoX100,加入1xTBS定容至100ml,加热溶解后置于4℃冰箱冷藏备用；7. Avidin-biotin孵育液：2.0μl avidin+2.0μl biotin+796μl Supermix抗体稀释液(滴度1：400)；8.DAB显色液：50mg DAB,10ml1×TBS,溶解后分装于试装1.0ml/支；9.DAB显色体系：6.5ml1×TBS+0.5ml DAB+2.5μl30%H2O2。实验方法1.实验大鼠被随机分为1组对照组和4组实验组,实验组按伤后3、12、24及72h分组,每组5只大鼠。建立SD雄性大鼠Marmarou模型：大鼠10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉后,剪除头顶部毛发,医用碘伏常规消毒,于冠状缝与人字缝之间切开头皮。30%H202腐蚀局部顶骨骨膜,将一枚无锈钢币(直径10mm,厚度3mm)粘贴于前囟与人字缝之间。将大鼠俯卧固定于海绵床上,450g圆柱型钢棒经1m长有机玻璃管自由落体垂直打击钢币,致伤后立即移开海绵床以防二次打击。对照组大鼠除未给予打击,其它处理均与损伤组一致。2.对照组、实验组大鼠于伤后3、12、24及72h经小动物磁共振成像仪7T/20cmBruker Biospec scanner行DTI扫描,设置扫描范围为胼胝体膝部至延髓下段。3.采用双盲法,严格对照大鼠脑立体定位图谱,利用磁共振仪工作站软件Paravision5.0在大鼠冠状位FA图像勾勒各感兴趣区,包括CC.LIC.RIC.LEC.REC.LPY. RPY.由于大鼠胼胝体和外囊为连续白质板层,二者的分界线依据大鼠脑立体定位图谱被统一定义为：扣带回下缘连线(前囟+1.60mm～-0.92mm).海马伞(fimbria)下缘连线(前囟-0.92mm～-2.80mm)和海马下缘连线(前囟-2.80mm～-5.30mm).同时勾勒双侧内囊(Bregma-O.26mm～-4.52mm)及锥体束(Bregma-8.3mm～-14.08mm)。每只大鼠可获得5组胼胝体、外囊、4组内囊及7组锥体束弥散参数,包含三个主要本征值λ1、λ2和λ3,以及两个衍生弥散参数ADC.FA的图像及相应数值。同时,经主要本征值算得RD和RA值。4.DTI扫描后,各组大鼠立即行脑组织灌流固定,开颅取出脑组织,置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)中固定过夜(16-18h)。下丘水平离断大脑及脑干,于胼胝体膝部和压部水平切除大脑额叶和枕叶而仅保留完整的胼胝体；于锥体交叉下缘2mm切断颈髓保留完整脑干,同时将脑干分为均等的左、右两侧。大脑及脑干组织块置于30%蔗糖浸渍沉淀后冰冻切片,分别行冠状位和矢状位切片,连续6片,片厚30μm。脑片直接粘附于明胶Tris.buffered saline(TBS)处理的切片上,切片时明确区分左、右大脑半球和脑干。由于单侧锥体束宽度约为1.2mm,因此单侧脑干仅切36片。5.脑片行β-APP、NF-L免疫组织化学DAB染色,观察各ROIs β-APP及NF-L染色特征。在Nikon Eclipse90i显微镜40倍下观察每张切片上述ROIs,200倍下随机获取5个区域,利用尼康显微镜图像分析系统NIS Element BR3.1计算单位面积(mm2)β-APP阳性轴索数、阳性染色面积百分比,NF-L平均光密度及积分光密度。6.标准化AD、FA与RA值(将实验组每只大鼠某感兴趣区的AD、FA或RA均值除以对照组5只大鼠相应部位AD、FA或RA均值)与β-APP单位面积阳性轴索数及NF-L平均光密度分别进行相关分析,以期建立DTI弥散参数与免疫组织化学检测DAI的对应关系,筛选诊断DAI最佳的生物标记物。7.收集湖北同济法医学司法鉴定中心法医理解剖案件未固定离体TBI人脑,经DTI扫描获取CC、IC、皮质脊髓束(corticospinal tract, CST) ADC及FA图像及数值,对比相应部位p-APP免疫组织化学染色结果,初步探讨DTI技术诊断离体TBI人脑轴索损伤的价值。统计分析所得数据经SPSS17.0软件分析。实验大鼠双侧内囊、外囊、锥体束DTI弥散参数及免疫组织化学数据,以及离体TBI人脑DTI弥散参数对比分析,采用双尾t检验。实验大鼠各组间DTI及免疫组织化学数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。设定P<0.05有统计学意义,同时采用Fisher’s post-hoc校正组间比较。结果：1.对照组大鼠各感兴趣区FA图像表现为均匀的高密度信号。实验组伤后3h,即可发现CC、LPY和RPY的FA图像出现信号减低、灰度增加,随着损伤时间延长FA灰度逐渐增加。AD及ADC图仅于伤后3h胼胝体发现灰度明显增加,LIC、RIC、 LEC、REC、LPY及RPY等部位未见明显灰度改变。各感兴趣各组间λ2和λ3图像均未见明显信号改变。2.弥散参数定量分析结果显示各感兴趣区AD、FA和RA值伤后3h显著下降,12-72h呈持续性下降,72h均达到最低值(ANOVA, P<0.05)。胼胝体、双侧锥体束ADC值伤后显著下降,24h达到最低值,24h与72h间无统计学意义,而双侧内囊、外囊ADC值伤后呈持续性下降,72h达到最低值。RD值未随损伤时间发生的一致的改变,且因部位而异,多重比较示胼胝体RD值于伤后24h开始出现轻度升高,双侧内囊、外囊及锥体束仅在伤后72h出现轻度升高。胼胝体λ2伤后24h轻度升高,而λ3各组间均无统计学意义：左侧外囊λ2伤后72h出现轻度升高,λ3伤后24h出现轻度升高；右侧外囊、双侧内囊及锥体束λ2、λ3均于伤后72h出现轻度升高。同一时间组左、右内囊、外囊及锥体束各弥散参数比较均无统计学意义(双尾t检验,P>0.05)。3.对照组大鼠白质各ROIs及实验组双侧内囊、外囊未检见β-APP阳性染色轴索；实验组大鼠伤后3h即可在胼胝体及双侧锥体束检见β-APP阳性染色轴索,轴索轻度迂曲肿胀、末端膨大,可见少量ARBs形成。伤后12-24h,轴索损伤的病理形态改变更为突出,β-APP阳性染色轴索数量及范围进一步增加,伤后72h达到高峰。β-APP定量分析结果示,伤后3h,胼胝体及双侧锥体束β-APP单位面积(mm2)阳性染色轴索数和阳性染色轴索面积百分比显著升高,随着伤后存活时间的延长而呈持续性升高,伤后72h达到峰值(单因素方差分析,P<0.05)。同一时间组,左、右锥体束β-APP单位面积阳性染色轴索数和阳性染色轴索面积百分比均无统计学意义(双尾t检验,P>0.05)。4.对照组大鼠仅在脑干粗大的锥体束出现NF-L弱阳性染色,大脑白质各ROIs均未见轴索NF-L阳性染色。实验组表现为弥漫性染色及轴索局部染色两种形式：各感兴趣区伤后3h,神经轴索NF-L阳性染色轻度增强,未发现ARBs;伤后12-72h,轴索染色逐步增强,同时胼胝体、内囊、外囊及锥体束见少量轴突膨体(axonal varicosities,AV)或ARBs,呈长梭形或腊肠状。大鼠脑组织NF-L免疫组织化学染色平均光密度及积分光密度定量分析,各感兴趣区NF-L染色平均光密度和积分光密度伤后3-24h急剧升高,随着伤后存活时间的延长而逐步升高,并在伤后72h达到峰值(单因素方差分析,P<0.05)。同一时间组NF-L免疫组织化学染色左、右内囊、外囊及锥体束平均光密度与积分光密度均无统计学意义(双尾t检验,P>0.05)。5.相关分析结果表明胼胝体AD、FA及RA均与β-APP单位面积阳性轴索数呈显著负相关,其决定系数(coefficient of determination, R2)分别为0.735、0.762、0.742(P<0.05)；左侧锥体束AD、FA及RA均与p-APP单位面积阳性轴索数呈显著负相关,其R2分别为0.815、0.833、0.828；右侧锥体束AD、FA及RA均与β-APP单位面积阳性轴索数呈显著负相关,其R2分别为0.857、0.877、0.873。结果表明FA与β-APP单位面积阳性轴索数的相关性优于AD和RA。各ROIs标准化AD、FA、RA分别与NF-L染色平均光密度相关分析,结果示胼胝体AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.838、0.847、0.837；左侧内囊AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.787、0.707、0.653；右侧内囊AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.687、0.627、0.654；左侧外囊AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.838、0.802、0.846；右侧外囊AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.902、0.849、0.885；左侧锥体束AD、FA及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.743、0.738、0.738；右侧锥体束AD、A及RA与NF-L平均光密度的R2分别为0.844、0.849、0.851。6.离体TBI人脑DTI研究显示,活体与离体对照组各部位FA值均无统计学意义；离体对照组、损伤组各部位ADC值明显低于活体对照组。损伤组与离体对照组ADC值无统计学意义,除胼胝体膝部外,各ROIs FA值均无统计学意义。弥散参数与免疫组化研究发现,损伤组FA值改变与病理结果相关性不明显,对称性白质FA值较低的一侧β-APP轴索染色为阳性。结论：1. Marmarou模型可稳定、可靠地复制大鼠DAI,经严格的实验控制,可较为理想地控制该模型的生物力学缺陷。2. β-APP和NF-L免疫组化染色可用于轴索损伤的早期检测,其变化规律能反映轴索损伤急性期的时序性。3.DTI弥散参数改变与轴索损伤标记物β-APP和NF-L免疫组化染色结果相吻合,本研究初步证实DTI弥散参数可作为早期发现和诊断DAI敏感的生物标记物,且能反映轴索损伤的时间信息。4.DTI技术对TBI人脑轴索损伤具有一定的指导价值。