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背景与目的冠状动脉性心脏病(coronaryarterydisease,CAD)简称冠心病,其主要病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。AS的发病机制尚不完全清楚,炎性反应的作用逐渐受到重视。CC趋化因子配体17(CCchemokine ligand 17,CCL17)属于CC趋化因子亚家族,AS斑块内的CCL17可以募集炎性细胞,同时抑制具有抗炎作用的调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的功能,使促炎抗炎反应失衡,斑块扩大且变得不稳定,可能具有促进CAD的作用。但是人群中CCL17与CAD的关系尚不明确,本研究拟探索人血清CCL17水平及CCL17单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与CAD发病的关系,并对关联分析阳性的SNP位点进行功能分析,以期为今后筛查CAD高危人群及发现新的治疗靶点提供线索。材料与方法1.连续入选2013年1月至2013年12月于北京协和医院行冠状动脉造影检查者作为研究人群,应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清CCL17水平并分析其与CAD的相关性。2.应用HapMap数据库和Haploview4.2软件对CCL17基因的SNPs进行连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)分析,筛选出标签SNP以覆盖整个CCL17基因的多态性信息。3.应用Taqman探针方法对研究人群的标签SNPs进行基因分型,分析其与CAD及血清CCL17水平的相关性。4.通过生物信息学软件TRANSFAC和Jaspar对关联分析阳性的SNP位点rs223828进行功能预测。5.rs223828位点被预测可能与转录因子激活蛋白1(activator protein,AP-1)结合,具有潜在转录调控功能,克隆rs223828位点所在区域序列,构建pGL3-Basic重组质粒,转染THP-1细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析转录活性。6.应用凝胶迁移(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)及超迁移(Super-shift)实验在体外水平分析rs223828位点C等位基因及T等位基因与AP-1结合能力的差异。7应用染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)及实时定量PCR技术在体内水平分析rs223828位点C等位基因及T等位基因与AP-1结合能力的差异。结果1.共813例CAD及158例非CAD个体入选本研究,CAD患者血清CCL17水平显著高于非CAD患者,且血清CCL17水平随病情由轻到重具有线性升高的趋势,与代表冠状动脉狭窄程度的Gensini评分(Gensiniscore,GSS)呈正相关关系。2.选取了 CCL17 基因的 5 个标签 SNP:rs223895、rs4784805、rs9302690、rs223899及 rs223828。3.共检测了 794例CAD及153例非CAD个体标签SNP的基因型,发现rs223899位点的次要等位基因T以及rs223828位点的次要等位基因T是CAD的危险因素,其中rs223828位点的T等位基因与外周血CCL17水平升高相关。4.TRANSFAC和Jaspar软件分析提示rs223828位点是AP-1的潜在结合位点,其中T等位基因更易与AP-1结合,从而促进CCL17基因的转录表达。5.双荧光素酶报告基因实验表明包含T等位基因的重组质粒表达的荧光素酶显著高于包含C等位基因的重组质粒,T等位基因可能具有增强转录的特性。6.EMSA实验表明包含T等位基因的生物素探针与核蛋白中的某一成分的结合能力高于包含C等位基因的探针,Super-shift实验与ChIP实验实验分别在体外和体内水平证明rs223828位点多态性影响了转录因子AP-1的结合。结论本研究首次发现人血清CCL17水平与CAD发病及严重程度相关,该基因的SNP位点rs223828可能通过影响转录因子AP-1的结合进而影响CCL17的表达,从而影响CAD的易感性。本研究尚存在一些不足之处,首先血清CCL17水平与CAD发病的因果关系需通过前瞻性队列研究进一步证实,另外rs223828位点的功能尚未在细胞及动物实验中证实。在之后的工作中,准备开展前瞻性队列研究以及细胞和动物实验,为筛查CAD高危人群及寻找新的治疗靶点提供线索。