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目的 1、采用酶消化法原代培养4月龄雄性新西兰大白兔的关节软骨细胞，观察正常关节软骨细胞体外培养去分化发生时间及其变化规律。 2、采用脂质体法将质粒pSV3neo导入第1代关节软骨细胞，构建关节软骨细胞系。 3、体外培养永生化关节软骨细胞，观察在不同时间永生化关节软骨细胞体外培养生物学特性的变化规律。 材料与方法 1、正常关节软骨细胞体外培养：无菌条件下，取4月龄雄性大白兔膝关节软骨，采用酶消化法获得单个软骨细胞，以DMEM培养基稀释至1×105／ml接种到培养瓶中，加10％胎牛血清，37℃ 5％CO2培养箱中培养，长满单层后传代。倒置显微镜下观察不同培养时间正常关节软骨细胞的形态学变化及增殖情况，免疫组化方法检测不同培养时间软骨细胞Ⅱ型胶原的合成情况，甲苯胺蓝和番红O染色检测不同培养时间软骨细胞糖胺多糖的分泌情况。 2、永生化关节软骨细胞的构建：采用脂质体法将质粒pSV3neo转入第1代关节软骨细胞，G418筛选3～4周有克隆出现后，用滤纸法和有限稀释法转移和挑选克隆，并扩大培养。采用免疫组化方法检测SV40LTAg在转化关节软骨细胞中的表达。 3、永生化关节软骨细胞及其生物学特性的检测：倒置显微镜下观察永生化关节软骨细胞在不同培养时间和传代次数的形态变化和增殖情况，免疫组化方法检测细胞Ⅱ型胶原的合成能力，甲苯胺蓝和番红O染色检测细胞糖胺多糖的分泌情况。并与正常第3代软骨细胞作比较。根据形态学变化情况、Ⅱ型胶原及糖胺多糖合成检测结果，用滤纸法和有限稀释法选择具有软骨细胞特征性表型的永生化关节软骨细胞进行扩增建系。结果 1 原代培养软骨细胞12h开始贴壁，48一72h完全贴壁，第2代以后软骨细胞基本在2一3h开始贴壁生长。关节软骨细胞早期以多角形细胞居多，也存在少数纺锤形细胞，从第6代起，纺锤形细胞增多。原代软骨细胞贴壁后生长迅速，第2、3、4代软骨细胞生长速度基本没有减低，从第5代开始，细胞增殖生长速度开始变慢，到第10代左右，细胞生长速度减缓，并最终停止增殖。前4代软骨细胞可检测到n型胶原免疫组化染色阳性，第5代后基本不着色。前4代软骨细胞糖胺多糖（GAG）分泌旺盛，细胞质及周围被甲苯胺蓝异染明显。但随着代次增加染色逐渐变浅，到第7代后基本不着色。 2、脂质体法转染第l代培养的软骨细胞经G418筛选后，大部分细胞死亡，但有新的细胞生长，一个月后获得12个细胞克隆。采用滤纸法将12个细胞克隆转移到12孔板继续培养。免疫组化染色显示，大T抗原在转基因软骨细胞的细胞核特异分布，而未转染关节软骨细胞则为阴性结果。 3、初期几代转染阳性细胞中部分细胞虽然能在G418培养基中生长，但形态呈梭形，H型胶原免疫组化染色及糖胺多糖甲苯胺蓝染色不明显，用有限稀释法去除，获得的细胞从形态上、H型胶原免疫组化染色及糖胺多糖甲苯胺蓝染色均呈软骨细胞特征性表现，将其进行扩增，在体外培养8个多月，传代50次以上，未出现退变迹象，确定为永生化关节软骨细胞。永生化关节软骨细胞与正常关节软骨细胞形态近似，主要是多角形，部分呈纺锤形，传代、冻存和复苏过程中细胞形态无明显改变，体积略小于正常关节软骨细胞。永生化关节软骨细胞在传代后30min内即可贴壁，4h内即可完全贴壁，12h内即开始增殖生长，24d即达对数生长期。永生化关节软骨细胞和正常关节软骨细胞生长曲线均呈倒置“S”形，群体倍增时间分别是75.71h和56.44h。永生化关节软骨细胞的生长有明显的血清依赖性，不能在无血清培养基中生长，可在5%血清培养基中生长，但细胞增殖速度明显低于在10%和20%血清培养基中的增殖速度。永生化关节软骨细胞和正常关节软骨细胞均不能在软琼脂内形成克隆。2xl的个/200 pl接种于BALB/c nu一/nu一裸鼠臀部肌肉内，6月内肉眼和组织学观察未见肿瘤形成。细胞功能的检测主要针对软骨细胞特征性产物糖胺多糖（GAG）和n型胶原。免疫组化的结果表明:永生化关节软骨细胞同第4代以内的正常关节软骨细胞一样，胞浆和胞膜上有抗11型胶原的阳性染色，软骨特异的糖胺多糖在永生化关节软骨细胞和第4代正常关节软骨细胞的胞浆和胞膜均有特异表达，甲苯胺蓝和番红O染色均呈阳性。结论 本实验所构建的永生化关节软骨细胞系在体外能长期培养并维持分裂增殖能力，其原始软骨细胞的特征性表型也可长期维持。从而为研究体内外各种环境因素对关节软骨细胞生长特性的影响提供了良好的实验对象;对永生化关节软骨细胞的增殖和分化特征的研究也有助于对正常关节软骨细胞生物学特性的进一步认识;而将永生化关节软骨细胞应用于软骨组织工程，可望解决种子细胞的来源问题。