空气微生物抗生素抗性基因计量方法构建与分布特征研究

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chengrui12345
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环境中普遍存在的抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes,ARGs,简称抗性基因)是人类过量使用抗生素而日益凸显的新型污染物,抗性基因整合在微生物内而产生耐药性,严重威胁人类健康。空气是抗性基因传播重要途径,由于缺乏较为科学的计量方法,空气中微生物抗性基因的浓度没有定论。  计量方法研究需要突破两个关键环节,一是高效富集空气微生物,传统非培养和培养法存在富集效率低和偏差大的不足;二是基于富集后的空气微生物样品提出计算方法。基于上述关键环节的研究,提出了空气微生物中抗性基因的计量方法,并使用该方法评估了不同典型环境中的多种抗性基因的浓度。  论文首先提出了非培养方式下富集宿主微生物的磁性微粒(Fe3O4)方法,结果表明磁性微粒富集下收获的空气样品DNA浓度和总量均高于传统方法且系统偏差较小。对非培养与培养法采集的微生物组成信息共线性考察,培养法样品与其传代样品间夹角为66.7°,非培养法中经磁性微粒富集和未经富集样品的夹角为19.4°~24.5°,污水DNA样品两次独立扩增产物间夹角22.3°,说明培养法偏差较大,经磁性微粒富集法偏差较小。对含菌配水和环境实际样品进行微生物磁性微粒富集,其最佳效率分别为90.4%和78.4%。影响富集效率的关键因素是溶液体系酸碱度,在酸性体系(pH=2.2)下有较高的富集效率。将空气样品中的微生物洗脱至溶液体系,经微粒富集后提取DNA,单位体积核酸浓度最高达到82.1ng/μL,比未经富集方法高1.3倍,单位体积空气收获量为20ng/m3,比未经富集方法高12.5倍,且磁性微粒富集方法应用于不同清洁程度环境中均有较高的DNA收获量,说明磁性微粒方法可获得较高的空气微生物富集效率。  其次,基于上述富集的空气微生物样品进一步提出了空气介质抗性基因计量方法。结合荧光染色计数、高通量测序分析、荧光定量PCR三种生物技术,构建的空气中微生物抗性基因的计量公式为CAbsolute=NCell×KDNAmass×CRelative。该计算公式通过三步实现,首先采用荧光染色显微计数确定空气微生物浓度(NCell,cell/m3),测量相对偏差为12.87%;然后通过微生物信息统计确定空气微生物平均DNA含量(KDNAmass,ng/cell),分析相对偏差为0.52%;最后通过荧光定量PCR确定相对丰度(CRelative,copies/ng),实验相对偏差为0.66%;计算公式的相对偏差为14.05%。通过烟雾舱校验计量方法的准确性,本方法与未经富集的计量方法的平均回收率分别为75.34%和13.27%,该误差在微生物领域可以接受。通过实际空气样品的采集检测,本研究在一定程度上提高了空气微生物抗性基因两个数量级的检测限。  最后,将建立的计量方法应用于不同环境中,对自然环境中污染严重的5类18种典型抗性基因计量评估,并考察了宿主微生物、移动基因元件等影响因素。空气中微生物抗性基因浓度为6.43×101~5.14×107copies/m3,其中β-内酰胺类、大环类脂类及喹诺酮类污染较为严重,季节性差异较小,地域性差异较为明显。以中国南方S市为例研究城市区域典型环境的分布特征,对社区农贸市场的研究发现,该区域空气微生物抗性基因浓度范围为104~109copies/m3,平均浓度为8.43×107copies/m3,显著高于其他环境。污水厂空气微生物抗性基因浓度范围为102~105copies/m3,磺胺类和四环素类浓度较高,污水污泥中抗性基因储量较高且目标厂区空气释放量达到1014copies/d,释放量较大。医院空气微生物抗性基因浓度整体范围在103~107copies/m3之间,其中β-内酰胺类、大环内酯类浓度范围105~107copies/m3。抗性基因与耐药菌浓度有较好的正相关关系,进一步研究医院金葡菌的耐药特性,分离的124株金葡菌对苯唑西林的耐药率为100%,对环丙沙星等四种常用抗生素的耐药率为70.2%~93.6%,多重耐药指数为0.559~0.716,耐药指数较高,存在较高风险。
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