β-石竹烯通过调节miR-218/HMGB1信号通路表达保护小鼠脑缺血性中风损伤的机制研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhaojianan1987
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MicroRNA(MiRNA)是一类内源性和非编码的单链小分子,由21-23个碱基组成,通过转录后水平的降解和抑制来调控靶基因,miR-218是新近发现的具有抗炎作用的重要因子。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种核蛋白,在真核细胞中广泛表达。在各种条件刺激下HMGB1可以释放至胞外,HMGB1释放方式之一是由已经死亡、正在坏死或受损伤的细胞被动释放,这些刺激因素包括炎症反应、免疫反应、细胞迁移、侵袭、扩增、分化、抵抗病原微生物和组织再生等。β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)是一种双环倍半萜烯,具有强大的抗炎活性,抑制炎症级联反应。研究表明,BCP能减少大鼠CIR损伤后的脑梗死体积。目的:本研究旨在探索在缺血性中风小鼠模型中miR-218和HMGB1的表达变化,以及二者的表达变化对缺血性中风造成的系列损伤的影响,以及二者的表达关系。在此基础上,进一步探索BCP对这条通路的调节作用。方法:体内实验:第一部分:随机将20g左右C57 B/L雄性小鼠分为不同组:假手术组(sham);损伤组(I/R)。假手术组小鼠只进行手术,不缺血;损伤组小鼠进行中脑动脉栓塞术(MCAO),缺血1h再灌24h。第二部分:随机将20g左右C57 B/L雄性小鼠分为不同组:假手术组(sham);损伤组(I/R);miR-218过表达组(miR-218 agomir);miR-218沉默组(miR-218 antagomir);HMGB1过表达组(GVHMGB1);HMGB1沉默组(RNAi-HMGB1);双过表达组(miR-218agomir+GV-HMGB1);双沉默组(miR-218 antagomir+RNAi-HMGB1)。假手术组小鼠只进行手术,不缺血;损伤组小鼠进行中脑动脉栓塞术(MCAO),缺血1h再灌24h;其余各组在进行中脑动脉栓塞术前一周,分别侧脑室注射miR-218 agomir、miR-218 antagomir、GV-HMGB1、RNAi-HMGB1、miR-218 agomir+GV-HMGB1和miR-218 antagomir+RNAi-HMGB1。第三部分:随机将20g左右C57 B/L雄性小鼠分为不同组:假手术组(sham);损伤组(I/R);给药组(BCP+I/R)。假手术组小鼠只进行手术,不缺血;损伤组小鼠进行中脑动脉栓塞术(MCAO),缺血1h再灌24h;给药组在进行中脑动脉栓塞术前五天,每天灌胃给药一次,第六天术前再次灌胃,术后缺血1h再灌24h。再灌注24小时后,除去死亡的小鼠,分别对存活小鼠进行神经行为学评分并统计。小鼠心内灌注多聚甲醛后,切片,分别进行fish检测、荧光实验,组化实验,HE染色实验和尼式染色实验。小鼠取脑后,分离皮层海马组织,皮层组织分别进行WB检测、qPCR检测、ELISA检测和双荧光素酶实验等。体外实验:体外培养原代神经元。第一部分:随机将接种好的细胞分为不同组:正常组(normal);损伤组(OGD)。正常组不做处理,正常培养;损伤组在培养第六天半换液时加入无糖培养基,12小时后,缺氧1h再复氧24h。第二部分:随机将接种好的细胞分为不同组:假手术组(normal);损伤组(OGD);miR-218过表达组(miR-218 mimic);miR-218沉默组(miR-218inhibitor);HMGB1过表达组(GV-HMGB1);HMGB1沉默组(RNAi-HMGB1);双过表达组(miR-218 mimic+GV-HMGB1);双沉默组(miR-218 inhibitor+RNAi-HMGB1)。正常组不做处理,正常培养;损伤组在培养第六天半换液时加入无糖培养基,12小时后,缺氧1h再复氧24h。其余各组在培养三天半换液时,分别加入miR-218 mimic、miR-218 inhibitor、GV-HMGB1、RNAi-HMGB1、miR-218mimic+GV-HMGB1和miR-218 inhibitor+RNAi-HMGB1,第六天半换液时加入无糖培养基,12小时后,缺氧1h再复氧24h。第三部分:随机将接种好的细胞分为不同组:正常组(normal);损伤组(OGD);给药组(BCP+OGD)。正常组不做处理,正常培养;损伤组在培养第六天半换液时加入无糖培养基,缺氧1h再复氧24h;给药组在培养第六天半换液时加入无糖培养基同时给药,12小时后,缺氧1h再复氧24h。复氧24小时后,对细胞进行fish检测、荧光实验;WB检测、qPCR检测、ELISA检测等。结果:实验结果表明:1、缺血性中风后,小鼠神经性为发生障碍,脑梗死面积增大,脑细胞存活率下降,尼式小体数量减少。2、体内体外都显示miR-218的表达显著下降,HMGB1的表达显著升高。3、荧光素酶检测表明miR-218和HMGB1可以直接结合。4、miR-218过表达对中风后的脑损伤有保护作用,HMGB1的过表达会加重脑损伤。miR-218的过表达可以在一定程度上逆转这样的损伤加重,提示miR-218可能为HMGB1的上游因子。5、TLR4和RAGE蛋白和mRNA的表达与HMGB1有很大的相关性,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6也与miR-218和HMGB1的表达有一定关系。6、缺血性中风后,BCP可以一定程度上逆转miR-218的降低。提示BCP可以通过对miR-218/HMGB1/RAGE/TLR4信号通路作用而发挥脑保护作用。结论:结果证实了miR-218抑制HMGB1/TLR4/RAGE信号的保护作用,进而抑制炎症、氧化应激和凋亡。此外,BCP通过激活miR-218、抑制HMGB1/TLR4/RAGE信号、降低IL-1β/IL-6/TN F-α的表达、抑制神经元死亡和炎症反应来潜在地减轻缺血性脑损伤。这些数据表明,BCP通过调节miR-218/HMGB1/TLR4/RAGE信号通路对缺血性脑卒中炎症损伤具有保护作用,为这种治疗方案的治疗机制提供了新的见解。
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