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第一部分脊索细胞和骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定目的分离兔髓核脊索细胞及骨髓间充质干细胞,通过形态学及流式细胞术对两种细胞进行鉴定,为下一步细胞试验奠定基础。方法4-6周龄新西兰兔4只,取胸腰段脊柱的髓核,用密度梯度离心法提取脊索细胞,同时取其股骨骨髓用FICOLL液分离得到骨髓间充质干细胞,光镜观察脊索细胞和骨髓间充质干细胞的生长情况,取原代脊索细胞脊进行电镜观察;对第3代的骨髓间充质干细胞进行表面抗原CD34、CD44、CD29、CD45的检测。结果光镜下观察原代脊索细胞呈圆形或椭圆形,胞体大,细胞增殖不明显。骨髓间充质干细胞呈梭形贴壁生长,旋涡状排列,细胞贴壁后折光性较差。电镜扫描发现脊索细胞大小约为20-30um,细胞形态呈圆形或者椭圆形,细胞膜表面可见大量糖原分布,细胞内可见大量的大小不一的囊泡存在。对第3代的骨髓间充质干细胞进行表面抗原的检测发现:细胞表达CD34、CD44阴性,CD29、CD45阳性。其中CD34的平均表达率为3.9%,CD44的平均表达率为4.4%,CD45的平均表达率为96.2%,CD29的平均表达率为88.1%。结论使用密度梯度离心法可以分离出脊索细胞和骨髓间充质干细胞,经过细胞鉴定两种细胞均表现出特征性特点,为进一步试验奠定了基础。第二部分接触性共培养脊索细胞促进骨髓间充质干细胞增值及定向诱导分化的实验研究目的分离兔髓核脊索细胞及骨髓间充质干细胞,通过共培养探讨脊索细胞对骨髓间充质干细胞增值能力及细胞表型的影响。方法4-6周龄新西兰兔4只,取胸腰段脊柱的髓核,用密度梯度离心法提取脊索细胞,同时取其股骨骨髓用FICOLL液分离得到骨髓间充质干细胞,光镜观察脊索细胞和骨髓间充质干细胞不同比例(1:2、1:1、2:1)共培养条件下细胞的生长情况、CCK-8法检测细胞增殖。脊索细胞和骨髓间充质干细胞共培养(1:1)后行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色检测骨髓间充质干细胞的细胞表型的改变情况。对共培养后的骨髓间充质干细胞进行相关基因表达的检测。结果光镜下观察原代脊索细胞呈圆形或椭圆形,胞体大,细胞增殖不明显。骨髓间充质干细胞呈梭形贴壁生长,旋涡状排列,细胞贴壁后折光性较差。CCK-8检测发现脊索细胞/骨髓间充质干细胞1:1组细胞增殖明显高于其余各组。甲苯胺蓝染色骨髓间充质干细胞单独培养组呈阴性,共培养组呈阳性。Ⅱ型胶原染色骨髓间充质干细胞单独培养组呈阴性,共培养组呈阳性。RT-PCR检测发现共培养组蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达分别为脊索细胞的2倍、1.35倍,而单独培养的MSC则表达阴性。结论在共培养条件下脊索细胞可以促进骨髓间充质干细胞增值,且细胞比例为1:1时更为显著;同时可以诱导其产生Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,表现出类软骨细胞表型。第三部分非接触共培养脊索细胞诱导骨髓间充质干细胞向类软骨细胞分化的实验研究目的分离兔髓核脊索细胞(NC)及骨髓间充质干细胞(MSC),通过非接触共培养探讨脊索细胞对MSC细胞表型的影响。方法取4-6周龄新西兰兔8只,取胸腰段脊柱的髓核,用密度梯度离心提取脊索细胞,同时取其股骨骨髓用FICOLL液分离,光镜观察脊索细胞和MSC等比例(1:1)非接触共培养条件下的生长情况。对非接触共培养(1:1)和单独培养的MSC行免疫组化及RT-PCR、Western-blot检测MSC的细胞表型的改变情况。结果原代脊索细胞呈圆形或椭圆形,细胞体积大,细胞增殖不明显。MSC呈梭形贴壁生长,呈三角形或梭形,旋涡状排列,两端呈尖性突起,细胞折光性较差。非接触共培养后,行甲苯胺蓝染色MSC单独培养组呈阴性,与NC非接触共培养的MSC组呈阳性。Ⅱ型胶原免疫组化MSC单独培养组呈阴性,与NC非接触共培养的MSC组呈阳性呈阳性。通过RT-PCR、Western-blot在基因及蛋白水平检测后发现:非接触共培养的MSC组其Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达明显增多,与对照组有显著性差异(p<0.05)。结论在非接触共培养条件下脊索细胞可以诱导MSC向类软骨细胞方向分化,为组织工程化髓核的种子细胞筛选提供新选择。第四部分联合移植脊索细胞和MSC阻止兔椎间盘退行性变的实验研究目的使用纤维环穿刺抽吸法造模兔椎间盘退行性变,联合移植脊索细胞(NC)及骨髓间充质干细胞(MSC)到退变的椎间盘内,观察退变椎间盘的变化。方法取1-1.5kg新西兰兔12只,手术对兔脊柱L3-4、L4-5、L5-6、L6-7四个椎间盘行穿刺抽吸髓核组织造模,造模2周后取等比例共培养3天脊索细胞和MSC移植到L4-5;单独的脊索细胞移植到L5-6;单独的MSC移植到L6-7。动物饲养2周后处死行髓核组织的免疫组化及Western-blot检测椎间盘退变的改变情况。结果穿刺抽吸髓核组织后2周行MRI检测兔椎间盘退行性变模型%ST2WI值较2周前相比明显下降,经过细胞移植后各组%ST2WI值均较对照组增高,尤其以联合细胞组为著。HE染色及甲苯胺蓝染色显示联合细胞移植后,椎间盘髓核内软骨样细胞明显增多,细胞外基质较各组丰富。Ⅱ型胶原免疫组化:联合细胞移植组在髓核内较其它3组可见大片棕色区域,其间存在深染的棕黄色颗粒,基质内可见黄染阳性的软骨样细胞,靠近细胞处染色较深。通过Western-blot在蛋白水平检测后发现:对照组Ⅰ型胶原呈现高表达,分别是联合细胞移植组、单独移植脊索细胞组、单独移植MSC组的24.78倍、13.63倍和14.03倍(p<0.05)。联合细胞移植组Ⅱ型胶原的表达较C组和D组增高(p<0.05)。结论脊索细胞和MSC共培养后联合移植可以阻逆兔椎间盘的退行性变,为组织工程治疗椎间盘退行性变提供新的思路。