乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种天然活性铁结合糖蛋白，广泛存在于动物的乳汁、血液、泪液、唾液、汗液、精液、羊水、胰液、胆汁、小肠液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。其中在乳中的含量最为丰富，特别是在初乳中浓度最高。LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅参与铁的转运，而且具有抗微生物、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能。为了深入的了解小型猪乳铁蛋白N叶基因的生物学活性和应用发展空间，为该蛋白的以后研究提供基础，进行了本实验。本实验进行了猪乳铁蛋白的克隆与表达研究，详细内容如下： 试验1：猪乳铁蛋白N叶基因的克隆与序列分析本研究采用外科手术取得泌乳15 d的小型母猪乳腺组织5 g，通过Trizol提取其中的RNA，并通过反转录方法得到PLF N叶的cDNA,以GenBank上登录的L77887序列为参考设计了一对引物进行PCR得到了猪乳铁蛋白的N-端基因(PLF-N)。克隆得到的基因长度为1099bp，包含了PLF上1077个编码序列。在1094-1096处设计引物时突变为TAA终止密码子，因此，此开放阅读框翻译后的蛋白包含了359个氨基酸残基。将此基因克隆入pMD19-T-simple载体，并进行测序。测序结果与GenBank上登录的序列号为AY306198、EF012241、L77887、M81327、M92089的猪乳铁蛋白进行比对，发现本研究中所克隆的PLF-N基因序列与其它基因报道基因同源性高达99％，确为猪乳铁蛋白基因。 试验2：猪乳铁蛋白N叶基因的大肠杆菌表达将连接有测序正确目的DNA片断的pMD19TS-PLF-N质粒用EcoR Ⅴ/EcoRⅠ双酶切后所得的带有EcoRⅤ、EcoRⅠ酶切末端的目的基因片断与用EcoRⅤ/EcoRⅠ双酶切pET-30a(+)原核表达载体后所得载体大片断用T4酶进行连接并转化到DH5α感受态细胞，通过酶切鉴定目的基因与载体的连接正确。将重组体转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导后，得到了目的基因的融合表达。分析结果表明，猪乳铁蛋白得到特异性表达。通过对诱导剂IPTG浓度的改变和诱导时间的长短进行摸索，得到重组菌体用TB营养液培养至OD600值在0.5左右，用终浓度为1.0 mM的IPTG诱导3 h，融合表达蛋白表达效果最好。 试验3：重组表达产物纯化及其生物学活性初步研究重组表达载体在30℃时，TB营养液中，用终浓度为1.0 mM的IPTG进行诱导3个小时后，用功率为60赫兹，超声波裂解1min，间隔1min，裂解20次获取包涵体，再进行包涵体裂解获得变性的目的融合表达蛋白。通过缓慢复性得到有活力的融和表达蛋白。通过纯化包涵体，可以使目的蛋白占全蛋白的百分比有占全菌的17.6％上升到占全包涵体蛋白的67.4％，基本能够满足进行体外抑菌试验的需要。将粗提的融合表达蛋白进行体外抑菌实验，结果表明融合表达蛋白有一定的抑菌活性。