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目的:目前研究表明,MPN在临床上最常见的突变有三种,即JAK2、MPL、CALR,被称为“驱动基因”。前期我们课题组研究发现,JAK2V617F患者的体内的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)升高,而MPL、CALR患者体内的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)降低,但其调控机制还不清楚。本研究通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术、磷酸化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列蛋白组学分析,对NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR type1和NB4-MSCV细胞系的全蛋白使用TMT标记后,对磷酸化修饰定量组学进行分析,对比磷酸化差异蛋白在突变基因细胞系与空载对照细胞系内的表达情况,比较分析各突变导致NAP不同改变的可能关键通路调控分子。方法:构建稳定表达JAK2V617F、MPLW515L、CALR type1突变基因以及空载体对照组基因NB4细胞模型后,本研究通过蛋白提取、胰酶酶解、TMT标记、高效液相色谱(HPLC)分级、亲和富集、液相色谱-质谱串联分析、数据库搜索、生物信息学分析方法,对样本中的磷酸化定量组学进行差异分析。结果:本研究通过蛋白差异修饰分析得出,NB4-JAK2V617F与NB4-MSCV相比,差异磷酸化修饰显著上调(>1.5)的位点有1434个,蛋白有704个,显著下调(<1/1.5)的位点有1244个,蛋白有749个;NB4-MPLW515L与NB4-MSCV相比,差异磷酸化修饰显著上调(>1.5)的位点有2405个,蛋白有1078个,显著下调(<1/1.5)的位点有460个,蛋白有320个;NB4-CALR type1与NB4-MSCV相比,差异磷酸化修饰显著上调(>1.5)的位点有26个,蛋白有24个,显著下调(<1/1.5)的位点有501个,蛋白有332个。通过GO(Gene Ontology)分类注释分析得出,NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR type1与NB4-MSCV细胞系相比,在细胞组成分类中,差异表达蛋白主要分布在细胞和细胞器;在分子功能分类中,差异表达蛋白主要参与结合和催化活性;在生物进程分类中,差异表达蛋白主要参与细胞进程和生物调节。通过亚细胞定位的软件wolfpsort对所提交的蛋白进行亚细胞定位注释得出,NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR type1与NB4-MSCV细胞系相比,差异修饰磷酸化位点对应蛋白的亚细胞结构定位主要在胞核和胞质中。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析得出,NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L和NB4-CALR type1的共有通路是剪接体;NB4-MPLW515L和NB4-CALR type1的共有通路是果糖和甘露糖代谢;NB4-JAK2V617F和NB4-MPLW515L的共有通路是非洲锥虫病,造血细胞谱系,柠檬酸盐循环(TCA)和丙酮酸代谢;NB4-JAK2V617F与NB4-CALR type1的共有通路是错配修复和白细胞跨内皮迁移。其中,Prp5蛋白在三种突变基因细胞系剪接体通路中的差异表达情况各不相同,在NB4-JAK2V617F中没有显著差异,而在NB4-MPLW515L和NB4-CALR type1中显著下调。Prp5的GO蛋白分类注释表明,Prp5的亚细胞结构定位在胞核上,在生物进程方面主要涉及RNA相关的剪接、调控以及基因表达过程;在细胞组成方面,主要是构成细胞核各个部分的组成元件;在分子功能方面,主要参与ATP相关的代谢以及核苷酸结合等。该结果也进一步证明了Prp5蛋白与JAK2V617F、MPLW515L、CALR type1突变细胞系NAP表达量差异可能存在一定的相关性。结论:本次研究我们利用构建的JAK2V617F、MPL、CALR三种突变体人NB4细胞系,通过磷酸化定量组学差异分析初步筛检出此三种突变体调控中性粒细胞胞内NAP表达的关键调控蛋白分子Prp5剪接体,后续将对其进行功能方面的验证。