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3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP）是一种多功能高值化学品。基因工程菌发酵生产3-HP是目前的研究热点。本研究以耐受高浓度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026）为出发菌株，构建基于串联表达载体和λ-Red同源重组技术的工程菌，并对工程菌生产3-HP的能力进行了探索，具体研究内容如下：1、克隆了K. pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC，构建了由甘油脱水酶自身组成型启动子pk调节的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC，电击转化K. pneumoniae DSM2026，获得重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC)，进行微氧摇瓶发酵及上罐发酵。结果：微氧摇瓶发酵15h后，重组菌的3-HP产量达到最大值7.2g/L，分别为野生型K. pneumoniae和K. p(pET-pk)的6.79和8.47倍，副产物乳酸和乙酸浓度也为整个发酵周期最低值的0.49g/L和1.07g/L；上罐发酵在维持低副产物水平的同时，3-HP产量达到14.2g/L，因此确定重组菌的最佳发酵周期为15h。2、克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1，在pET-pk-dhaB-puuC基础上，构建了耦合3-HP生产与NAD+再生的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC-GPD1，对重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)进行微氧摇瓶发酵。结果：引入GPD1后，重组菌生物量较K. p(pET-pk-dhaB-puuC)有明显提升，而3-HP最高值降为1.45g/L，分别为野生型K. pneumoniae和K.p(pET-pk)的1.93倍和2.39倍，乙酸浓度为发酵周期最低值0.54g/L。3、克隆了λ-Red同源重组系统所需的重组酶基因beta、gam、exo以及上游启动子序列区，构建重组质粒pET-ParaB-Red，并成功转化K.pneumoniae DMS2026，得到重组菌K. p(pET-ParaB-Red)。L-阿拉伯糖梯度诱导实验表明，在40mmol/L L-阿拉伯糖诱导90min后重组酶获得最佳表达量。将连续三轮易错PCR扩增的副产物基因片段lldD、pta、poxB经三轮电击转化至重组菌K. p(pET-ParaB-Red），通过高通量筛选获得了两株性状明显的突变菌株K. pneumoniae(32#)和K. pneumoniae(25#)。摇瓶发酵实验结果：K. pneumoniae(32#)的副产物乙酸和乳酸维持在0.4g/L以下，而3-HP也持续低表达，最高值仅为0.33g/L。K. pneumoniae(25#)3-HP产量浓度最高达到0.96g/L；但在副产物生产上，只能较好地控制乳酸水平（＜0.4g/L），而乙酸维持在1.5g/L左右波动。此外，测序结果表明，两株菌在核酸及氨基酸水平上都发生了不同变化；连续传代实验表明，两株重组菌的突变均能稳定遗传，没有发生回复突变。