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每年因为猪流行病的传播和发病给世界的养猪业造成了巨大的经济损失,在这些流行病中,PCV2是一种广泛存在的猪流行病病毒,具有很强的致病性,它可以与许多病原并发和继发感染,是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。有研究表明,不同的猪品种由于遗传差异对PCV2的抗病反应也不同。我国的地方猪种莱芜猪较西方猪种有更好的抗PCV2的特性。miRNA作为一类单链非编码小RNA分子具有在转录后水平的调控作用,在动物的发育、增殖、分化和凋亡过程中有着重要的作用。本研究主要针对莱芜猪和大长二元杂交猪对PCV2的不同抗性开展进一步的研究。在RNA-seq的基础上,通过检测预测靶基因的m RNA和蛋白水平的分析,荧光素酶活性检测,确定了ssc-miR-122的靶基因。针对莱芜猪和大长杂交猪肺组织中差异表达的miR-122的表达变化和所调控的基因进行分析,确定了ssc-miR-122启动子活性及其关键调控区,并对启动子的关键调控区的SNP进行了分析。最后对ssc-miR-122与PCV2复制的关系进行了探讨。研究结果如下:1.miR-122表达量的检测及靶基因的验证。(1)利用qPCR对猪不同组织中ssc-miR-122的表达量进行了检测。结果表明与未攻毒莱芜猪相比,PCV2攻毒的莱芜猪在扁桃体、脾脏中上调表达,其中在心脏中上调较明显。在淋巴结、小肠、大肠、肝脏中有下调的表达趋势。与未攻毒大长猪相比,PCV2攻毒的大长猪在扁桃体、大肠、肝脏、和脾脏中有上调表达的趋势,其中在肝脏中上调表达十分显著。在淋巴结、小肠、心脏中有下调表达的趋势。(2)利用qPCR检测肺组织中预测靶基因NFAT5和NPEPPS的m RNA表达量变化。NFAT5和NPEPPS的表达量在攻毒与未攻毒的莱芜猪和大长猪肺组织中都是下调表达的。(3)预测了miRNA的靶基因。通过Targetscan、pic Tar、miRanda等在线预测数据库预测ssc-miR-122的靶基因为NPEPPS和NFAT5。其中NFAT5是激活的核因子5,是转录因子家族的一类,在哺乳动物的免疫应答中,NFAT5家族蛋白在诱导基因转录方面有着重要的作用。NPEPPS在MHC I类分子的抗原加工途径中起作用,涉及细胞毒性T细胞表位前体的N-末端修饰。(4)细胞水平上的验证。首先确定了ssc-miR-122的转染条件为30nmol并在转染后48h达到最佳转染条件。转染后,细胞内NFAT5和NPEPPS的m RNA水平都显著降低(P<0.05);Western blotting检测了NFAT5和NPEPPS的蛋白水平的变化,结果表明NFAT5和NPEPPS的蛋白水平都显著下调(P<0.05),与m RNA水平的表达变化一致。(5)Ssc-miR-122与NFAT5和NPEPPS的靶向关系。将构建的NFAT5和NPEPPS的野生型3’UTR和突变型3’UTR的双荧光素酶载体与ssc-miR-122 mimic共转染,结果表明野生型的荧光活性显著降低(P<0.01),表明NFAT5和NPEPPS是Ssc-miR-122的靶基因。2.莱芜猪与大长杂交猪的ssc-miR-122启动子的转录调控分析(1)利用测序发现莱芜猪和大长杂交猪的ssc-miR-122存在两种片段长度的启动子,其中一种比另一种长7bp,通过双荧光素酶报告基因分析两者活性存在显著差异(P<0.001)。通过启动子删除实验确定了ssc-miR-122的核心启动子区,发现在前体上游-4587至-3594bp处存在转录激活活性。并在该区域发现一个7bp(AACCCCC)的插入缺失突变。通过检测7bp的完全型和缺失型启动子发现,插入型的启动子活性明显高于缺失型的启动子活性(P<0.001)。通过在线预测(http://www.genomatix)分析在这7bp的插入缺失突变处存在转录因子CART家族的存在。(2)(AACCCCC)插入缺失多态性的群体水平检测。通过PCR扩增和测序检测了44头莱芜猪、49头杜洛克猪、56头长白猪、47头约克夏猪在该位点的多态性。发现杜洛克猪没有插入型,而长白猪和约克夏猪的插入型比例高于莱芜猪,但都不符合哈代温伯格平衡定律,说明存在选育的作用。3.miR-122对PCV2的复制效应不同类型启动子在PCV2接毒后的活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明在PCV2接毒后插入型的启动子活性显著升高,而缺失型的启动子活性变化不明显。通过过表达miR-122,检测miR-122对PCV2复制的效应。结果表明miR-122能明显抑制cap蛋白的表达。说明miR-122能有效抑制PCV2的复制。综上所述,通过本研究我们确定了莱芜猪和大长二元杂交猪肺组织中差异表达的miR-122,确定了两个与免疫相关的靶基因。说明miR-122可能是通过作用于NFAT5和NPEPPS这两个靶基因的调控来参与机体免疫相关的反应。其次对miR-122的转录调控进行分析,筛选出一个启动子区的与抗PCV2相关的分子标记,为培育对PCV2抗病性的猪提供了依据。