研究背景：肥胖是目前世界最常见的代谢性疾病之一。肥胖症患者并发心脑血管疾病及2型糖尿病等内分泌代谢疾病几率明显增高。若机体能量摄入高于能量耗损,多余的热量便会以脂肪组织形式储存于机体,当脂肪组织含量超过生理需要时,遂演变成肥胖。增加能量消耗已逐渐成为潜在预防及治疗肥胖及其相关疾病的有力手段。脂肪组织按形态和功能分为两种形式：白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)。WAT储存能量,BAT则可加快体内代谢,促进能量消耗。增加BAT活性或数量可以有效降低体重并改善体内葡萄糖稳态。研究证明在寒冷、p3受体激活等条件下,体内部分WAT可以向BAT转变,这种转变称为”白色脂肪棕色化(棕色化)”。棕色化可以抑制饮食所致的肥胖及2型糖尿病等诸多代谢异常。众所周知,锻炼对肥胖和糖尿病等代谢性疾病的预防和治疗具有十分积极的作用。2012年哈佛大学研究团队发现运动可以促进骨骼肌分泌一种小分子多肽"irisin"。Irisin是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5 (FNDC5)经蛋白水解酶水解后形成的可分泌多肽片段。运动可以增加PGC-la表达,后者可上调FNDC5,并促进其剪切。FNDC5在切除N端信号肽后,在蛋白水解酶作用下形成的一段约110个氨基酸的多肽片段,即为irisin。年龄,体内骨骼肌含量和身体状态是血液中Irisin含量的重要影响因素,如年轻男性运动员血清中irisin含量明显高于中年肥胖女性;2型糖尿病患者血清irisin含量明显低于正常人。研究发现小鼠体内高表达irisin可以增加总体能量消耗,改善高脂饮食所致的肥胖及糖耐量。然而,irisin促进白色脂肪向棕色脂肪转变的分子机制和信号传递系统尚未知。研究目的：在毕赤酵母中建立高效的重组irisin表达体系,在体外研究重组irisin在脂肪细胞棕色化过程中的作用,并阐明其分子机制；体内研究重组irisin对高脂饲养的肥胖小鼠的作用。研究方法：1.人重组irisin蛋白的表达与纯化。2.点突变irisin cDNA以确定重组irisin糖基化位点。3.培养大鼠原代脂肪细胞。4.3T3L1脂肪前体细胞分化为成熟脂肪细胞。5.重组irisin与脂肪细胞膜结合试验。6.RNA提取及qRT-PCR检测相关基因的表达。7.细胞免疫荧光染色(ICC)检测irisin处理后成熟3T3L1细胞内UCP1的表达。8.Western blot检测irisin处理后原代大鼠脂肪细胞及成熟3T3L1细胞后,UCP1水平和信号通路蛋白的活化情况。9.动物实验观察重组irisin对高脂喂养的肥胖小鼠白色脂肪棕色化、体重和糖耐量的影响。10统计学分析：本研究全部实验重复3次及3次以上,结果使用单因素方差分析或Student’s t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果：1.重组irisin表达和纯化以及其糖基化：(1)毕赤酵母可表达高浓度重组irisin o(2)考马斯兰染色显示重组irisin具有分子量为15,22和25的三条带。(3) PNGase F去糖基化酶处理后,分子量为25和22的两条带消失。(4)突变第7位和第52位天冬酰胺后,分子量为25的条带消失。2.重组irisin可以促进大鼠原代脂肪细胞和成熟3T3L1细胞棕色化：(1)实时定量PCR和Western blot结果显示重组irisin处理大鼠原代脂肪细胞4天后,UCP1基因和蛋白水平明显增高,且呈浓度依赖性。(2)实时定量PCR显示irisin处理分化的3T3L1细胞4天后,诸多棕色脂肪标志物基因水平明显增高。(3) Western blot和ICC结果显示,irisin处理后,成熟3T3L1细胞内UCP1水平明显增高。(4)实时定量PCR和Westernblot结果显示突变重组irisin的两个糖基化位点后,其棕色化功能较未突变者降低。3.ERK和p38 MAPK信号传导通路参与Irisin诱导的白色脂肪组织棕色化：(1) Western blot结果显示,Irisin处理原代大鼠脂肪细胞和成熟3T3L1细胞5,10,20,30分钟后,两种脂肪细胞的磷酸化ERK和p38MAPK蛋白表达水平明显升高。(2)用ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580分别抑制irisin诱导的ERK和p38磷酸化后,实时定量PCR和Western blot实验结果显示,两种抑制剂均明显降低irisin所致的UCP1增加。4.免疫荧光结果显示irisin可以结合在成熟3T3L1细胞的胞膜上。5.重组irisin可以调节高脂饲养的肥胖小鼠体重及葡萄糖稳态：(1)向高脂喂养的肥胖小鼠腹腔注射重组irisin14天,诸多棕色脂肪标志基因明显增高。(2)免疫组化结果显示腹腔注射重组irisin后,UCP1表达明显增高。(3)注射重组irisin后,肥胖小鼠体重降低。(4)腹腔注射葡萄糖耐量试验(IGPTT)结果显示,注射irisin后,小鼠糖耐量得到明显改善。(5)注射重组irisin后,肥胖小鼠空腹胰岛素水平降低。结论：1.毕赤酵母可以高浓度表达重组irisin蛋白,且重组irisin蛋白具有两个糖基化位点。2.重组Irisin可以促进大鼠原代脂肪细胞和成熟3T3L1脂肪细胞转变为棕色脂肪细胞。3. Irisin的棕色化功能是通过活化ERK MAPK和p38MAPK信号传导通路实现的。4.脂肪细胞膜上或许有irisin受体存在。5.重组Iris in可以降低高脂喂养的肥胖小鼠体重并改善其葡萄糖稳态。研究背景：当摄入体内的能量多于机体消耗的能量时,会导致脂肪组织的积聚从而引发肥胖。棕色脂肪组织(BAT)是一种产热器官,它可以将储存在白色脂肪(WAT)中的能量以热能的方式消耗掉。BAT的这种产热能力主要依靠线粒体解耦联蛋白(UCP1)实现的,后者可以解偶联电子传递链,促进热量的产生。因此增加BAT含量及脂肪组织中UCP1的表达,已成为预防及治疗肥胖和相关性疾病的一个重要手段。Irisin,一种运动后表达增高的肌因子,证明可以通过增加线粒体UCP1表达,促进白色脂肪组织棕色化。在高脂喂养的肥胖小鼠体内高表达Irisin前体(FNDC5)可以通过增加能量消耗起到减重和改善胰岛素抵抗。本课题组在前期研究中通过向高脂喂养的肥胖小鼠腹腔注射重组irisin蛋白证明了这一论点。尽量很多研究已证实在动物体内Irisin对预防及治疗代谢性疾病(包括肥胖和2型糖尿病)有很重要的作用,然而,irisin在人体内的生理作用和增加产热功能一直饱受争议。研究目的：研究Irisin对人皮下白色脂肪组织(scWAT)影响及其作用机制。研究方法：1.重组irisin蛋白的制备。2.人scWAT的获取3.人原代脂肪细胞的分离及培养。4.人原代脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化。5.新鲜脂肪组织块的培养及Irisin对其处理.6.RNA提取及实时定量qRT-PCR检测相关基因的表达.7.免疫荧光染色检测Irisin处理后分化成熟人脂肪细胞内UCP1的表达。8. Western blot检测Irisin处理后人皮下白色脂肪组织块中UCP表达和信号通路蛋白的表达。9.统计学分析：本研究所涉及实验均重复3次及3次以上,结果采用单因素方差分析或Sudents’t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果：1.人成熟脂肪细胞的获取。2.重组Irisin可以促进scWAT源的人成熟脂肪细胞棕色化：实时定量PCR和免疫荧光结果显示重组irisin处理人成熟脂肪细胞4天后,UCP1基因和蛋白水平明显增高.3.重组irisin抑制脂肪前体细胞分化和棕色化：在原代脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化整个过程中加入重组irisin处理18天,成熟的脂肪细胞数目较未处理组明显减少,白色脂肪细胞分化的相关基因表达明显降低,同时UCP1基因和蛋白水平也均明显降低。4. Irisin通过激活ERK和p38信号通路促进新鲜皮下白色脂肪块棕色化：(1)重组irisin处理新鲜皮下脂肪块4天后,western blot检测UCP1蛋白水平明显增高,且不同人对irisin反应不同。(2)Western blot结果显示,Irisin分别处理新鲜皮下脂肪块10,20,30,60分钟后,脂肪组织中磷酸化ERK和p38水平均明显升高。(3)用U0126(ERK抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)分别抑制irisin诱导的ERK和p38磷酸化后,Western blot实验结果显示,两种抑制剂均明显降低irisin所致的UCP1增加。5.人皮下脂肪组织中褐色基因的基础表达水平和对irisin刺激后的棕色化反应正相关：(1)定量PCR显示不同人来源的脂肪组织块对重组Iris in所引起的棕色化反应不同。(2)不同人来源的脂肪组织块褐色脂肪基因的基础水平表达不同。(3)人皮下脂肪组织中褐色基因的基础表达水平和对irisin刺激后的棕色化反应正相关。结论：1.重组irisin可以促进人皮下成熟脂肪细胞棕色化。2.重组Irisin可以抑制人皮下脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化。3.重组irisin通过激活ERK和p38信号通路促进人scWAT棕色化。4.人皮下脂肪组织中褐色基因的基础表达水平和对irisin刺激后的棕色化反应正相关。