上皮细胞黏附分子(EpCAM)是细胞膜表面的一种糖蛋白，是利用单克隆抗体17-1A发现的人类肿瘤细胞表面抗原分子之一，其主要功能是参与细胞基底膜之间的同源黏附。上皮来源的肿瘤细胞中表达明显增强。作为细胞表面主要抗原，上皮细胞黏附分子作为免疫治疗靶分子引起了广泛的重视，在临床上试验研究中，将EpCAM抗体对结肠癌肿瘤病人进行治疗，有效减少术后的死亡率。在1995年，德国已经允许上皮细胞黏附分子的抗体应用于临床，治疗结肠癌晚期手术病人。上皮细胞黏附分子基因不仅同上皮组织的发生发展有关，而且该基因在肿瘤中高表达，与肿瘤的预后也密切相关。研究发现，上皮细胞黏附分子在上皮来源的多种肿瘤中都出现高表达，但高表达原因不清。对上皮细胞黏附分子基因上游序列分析发现，它的启动子没有一个典型的启动子所具有的TATA盒。对该基因启动子功能研究的文献中，以对启动子功能和区域定位研究为主，主要分析上皮细胞黏附分子基因启动子的启动能力、启动子具体的范围大小。至于该基因在肿瘤中为什么出现高表达，尚没有相关报道。 目前，在对肿瘤的研究中，引起重视的一个方面是肿瘤表观遗传学的改变；这种改变主要为DNA修饰和组蛋白的修饰，这种表观遗传学改变并没有DNA碱基序列的改变，但是却可以引起基因表达的改变。表观遗传学的改变引起的基因表达的改变主要表现在三个方面：DNA修饰，组蛋白修饰和RNA干扰。目前肿瘤表观遗传学的研究中以DNA甲基化和去甲基化为研究的热点之一。在肿瘤的发生中，出现基因组的整体去甲基化，和部分区段的高甲基化，这些高甲基化和低甲基化都可以出现在基因启动子区域的CpG岛。抑癌基因启动子区域的CpG岛甲基化之后，会出现基因表达的降低，甚至失表达，抑制肿瘤发生的功能降低，从而导致肿瘤的发生；反之，在一些癌基因启动子区域的CpG岛出现去甲基化后，却可以诱导基因表达增高，进一步加快肿瘤的发生发展。上皮细胞黏附分子基因，在正常的消化道上皮表达较低甚至不表达，但是在上皮出现异常增生和永生化时，该基因却出现表达的异常增高。目前研究表明EpCAM基因对于肿瘤的发生具有促进作用，可以上调c-myc癌基因的表达。研究表明：抑制上皮细胞黏附分子基因的表达可以有效抑制肿瘤的生长；对于结肠癌的来说，EpCAM分子的抗体，可以有效的治疗肿瘤，说明该分子在肿瘤的发生中有着重要作用。但是该基因在肿瘤中高表达的机制仍然不清。该基因的高表达，是否也存在表观遗传学的改变?在该基因启动子区是否存在CpG岛?该基因的表达是否有关?我们首先通过网络数据库，查找上皮细胞黏附分子基因转录起始位点上游1500bp和下游1000bp的基因序列，通过网络数据库分析该段基因序列，发现在该段基因序列中确实存在着一个CpG岛，并且跨度较长，但是对于其在肿瘤中甲基化状态研究以及和基因表达的关系未见相关报道。在本研究中，通过BSP(bisulfitesequencingPCR)技术，分析在上皮细胞黏附分子高表达和不表达细胞中该基因启动子区域的甲基化状态，研究CpG岛甲基化和该基因表达的关系和CpG岛的甲基化状态，探讨上皮细胞黏附分子在肿瘤中高表达的机制，为开发甲基化分子诊断的试剂盒提供理论依据。 第一章：EpCAM基因概述及启动子区CpG岛甲基化状态分析 本章主要介绍了EpCAM的一般情况。首先介绍EpCAM基因家族，和EpCAM基因定位。EpCAM的结构和在细胞膜上的分布。其次简单介绍了EpCAM在不同组织中的表达情况，以及在胚胎发育中EpCAM基因的表达改变。EpCAM作为肿瘤预后因子，和肿瘤分类的分子标志的意义。最后我们根据网络资源，查找EpCAM基因启动子区域的基因序列，然后进行启动子区域的CpG岛的分析。通过两个不同的网络数据库对EpCAM基因的启动子区域核酸序列进行分析后发现：在EpCAM基因启动子区域确实存在着一个较长的CpG岛，并且该CpG岛，横跨第一外显子部分，一直延伸到第一内含子部分。根据这两个数据库分析显示，在EpCAM基因启动子区域CpG岛的主要部分互相符合，表明在该段CpG岛的甲基化可能同EpCAM基因的表达具有相关性。根据对EpCAM基因启动子研究的文献，EpCAM基因启动子主要功能区在该基因上游-687bp范围以内，我们在分析EpCAM启动子区域CpG岛的研究范围时选择该基因上游至基因中的-492-+612范围内。 结论：EpCAM的启动子区域具有一个理论上的CpG岛，该CpG岛的甲基化或者去甲基化可能同EpCAM的失表达或高表达可能有关。 第二章：EpCAM基因启动子区CpG岛甲基化状态同基因表达的关系 目的：研究EpCAM基因中启动子区域CpG岛的去甲基化与基因表达关系。 材料和方法：运用免疫组织化学技术检测EpCAM在结肠癌肿瘤中高表达情况。运用实时荧光定量PCR技术检测EpCAM在结肠癌组织和正常组织中表达的异同；运用甲基化PCR检测结肠癌组织和正常的组织中EpCAM基因启动子区域CpG岛甲基化状态。运用荧光定量PCR检测不同来源的细胞系中EpCAM的表达水平；运用甲基化PCR检测在EpCAM表达不同的细胞系中，该基因启动子区域CpG岛甲基化状态。通过比较上皮细胞黏附分子基因表达高低和甲基化状态的比较，来分析上皮细胞基因启动子甲基化和基因表达的关系。 结果：在EpCAM高表达的结肠癌组织中，EpCAM启动子区域的CpG二核苷酸大都以去甲基化形式存在，与之相比在正常的组织中，EpCAM基因启动子区域的甲基化较肿瘤组织中明显增加。同样，在EpCAM高表达的细胞系中，启动子区域的CpG岛以去甲基化形式存在，在EpCAM不表达的细胞系中启动子区域的CpG岛中的CpG二核苷酸是以甲基化形式存在，并且甲基化范围较大。 结论：该基因在肿瘤组织中的高表达可能与该基因启动子区域的去甲基化有关。EpCAM启动子区域的甲基化与该基因的失表达可能有关。 第三章：DAC对EpCAM基因启动子区CpG岛甲基化状态及表达的影响 目的：研究EpCAM启动子区域去甲基化是否会重新启动该基因的表达。 材料方法：选择EpCAM基因不表达的两种细胞系：血液系统肿瘤细胞系K562和肝癌细胞系HepG2，利用去甲基化的药物5-氮-2-脱氧胞苷(DAC)进行共同培养，使这两种细胞系中EpCAM基因启动子区域的CpG岛中的CpG二核苷酸出现去甲基化；提取细胞基因组DNA，经过亚硫酸氢钠修饰后，利用甲基化PCR结合基因测序检测CpG岛中的CpG二核苷酸去甲基化状态；在EpCAM基因启动子区域的CpG岛出现去甲基化后，利用免疫组化和荧光定量PCR两种方法检测EpCAM基因的表达。 结果：这两种细胞系通过药物诱导后，在EpCAM基因启动子区域的CpG岛出现了去甲基化状态，实时荧光定量PCR和免疫组织化学检测EpCAM基因表达并没有出现相应增高。 结论：在EpCAM基因中，启动子区域CpG岛高甲基化可能不是该基因失表达的主要因素，在该基因的表达调控中，可能还有其它的因素参与。去甲基化也不是该基因高表达的主要原因。