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目的:1.构建携带超抗原SEA基因的的低免疫原性慢病毒载体。2.探讨携带超抗原SEA基因慢病毒载体靶向膀胱肿瘤细胞BIU-87细胞表达能力。3.研究慢病毒载体表达的SEA蛋白刺激周围淋巴细胞的增殖作用及其机制抗肿瘤作用。方法:应用Genebank搜索h TERT-CMV启动子及SEA目的基因序列,设计寡聚核苷酸引物,以原有慢病毒载体为模板,应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法获得启动子及目的基因序列。将获取基因构建到慢病毒载体质粒中,基因测序正确后,转入感受态细胞中扩增、收集。利用包装系统质粒共转染293FT细胞中包装病毒,获取目标阳性空斑,试剂盒方法提取慢病毒的基因组,进行双酶切鉴定。通过293FT细胞感染扩增病毒,采用超速离心法获取浓缩的病毒上清液,病毒滴度通过荧光滴度法测定。梯度浓度病毒液转染膀胱肿瘤BIU-87细胞株后,提取细胞RNA进行RT-PCR反应,目的基因的PCR产物测序,Western blot方法检测SEA蛋白的表达。病毒转染后的BIU-87细胞与人淋巴细胞共培养,不同时间点后采用倒置显微镜观察淋巴细胞与肿瘤细胞生长情况,收集细胞培养液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测共培养对细胞因子分泌的影响。结果:1.PCR产物基因测序证实慢病毒质粒中目的基因与启动子连接正确,载体质粒大小为10458bp,未发现明显碱基突变。荧光滴度法检测病毒滴度为(4.30±2)×109TU/m L。构建的慢病毒载体双酶切产物基因测序与预期结果相同。2.Western blot方法结果显示BIU-87细胞中有SEA基因翻译的超抗原SEA蛋白存在。3.实验组淋巴细胞与转染后的BIU-87肿瘤细胞共培养24、48、96 h后,BIU-87细胞数量明显少于空白对照组。ELISA结果显示实验组IL-2、IL-4分泌明显高于空白对照组。结论:1.成功构建完成表达SEA基因的重组慢病毒载体,且对重组慢病毒载体基因组及毒性进行检测,扩增、纯化一定数量病毒载体用于体外实验研究。2.应用构建的重组慢病毒载体体外作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞株,初步验证载体对膀胱肿瘤的治疗作用及其机制。