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艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征。艾滋在世界范围内流行,其中主要是1型HIV病毒给人类健康带来严重威胁。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,自从HIV被发现以来,被感染者已逾7千万人,2015年底全球仍有3千6百多万艾滋患者,15岁至49岁成人HIV感染率高达0.8%[1]。2012至2014年连续三年,我国艾滋病发病超过4万人/年[2]。目前高活性抗逆转录病毒治疗(Highly Active AntiretroViral Therapy,HAART)已经可以抑制艾滋感染者体内病毒的复制,延长患者寿命并使其可以像健康人一样正常生活。然而抗逆转录药物需要每天服用,37.74%的服药患者出现消化道反应、肝功能异常等副作用[3],而且HAART治疗不能从根源上斩断艾滋的流行,疫苗的研发正是当务之急。HIV-1包膜糖蛋白(envelope glycoprotein,Env)gp160 在成熟过程中水解为 gp120(surface glycoprotein,SU)和gp41(transmembrane protein,TM),这两个蛋白单体通过非共价键结合为异源二聚体,三个二聚体组装成成熟的三聚体刺突铆定在病毒包膜上。病毒入侵宿主细胞时,gp120上的CD4结合位点识别CD4细胞表面受体分子,引发Env变构靠近细胞膜从而发生膜融合,因此包膜蛋白是阻止病毒感染的重要切入点,也是疫苗研究的重要靶点[4]。广谱中和单抗N6,VRC01,b12,2F5等抗体分别针对gp120上的CD4结合位点和 gp41 上的近膜外区(Membrane Proximal External Region,MPER),能够实现对多种型别病毒的高效中和[5,6,7,8]。然而根据这些抗体表位设计的疫苗仍未取得理想的效果。RV144是第一个被证实具有降低HIV-1感染效果的疫苗。实验中,表达 E 亚型 Env 和 B 亚型 Gag(group specific antigen)、Pro(protease)的金丝雀痘病毒载体为初免,B/E亚型gp120和铝佐剂加强免疫,三年半后受试者仍保持31.2%的疫苗保护率[9]。体内具有高水平阻断和结合抗体,可能对艾滋感染有保护作用[9]。另有文献报道,通过对BG505毒株的Env进行改造,可以实现体外的可溶性表达,得到近似天然的蛋白三聚体[10]。重组包膜蛋白BG505 SOSIP.664和B41 SOSIP.664均可在兔子体内诱导得到较强的广谱中和抗体[11]。这些报道对艾滋疫苗的进一步研究提供了新的方向和信心。本研究的目的是通过优化HIV-1 gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现gp140蛋白在哺乳动物细胞HEK293中高效表达,并对纯化获得的蛋白进行抗原性质鉴定。本研究选择B亚型HIV-1 NL4-3基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性连接、三聚体辅助折叠序列等方法优化设计,确定了最终的重组克隆SOSIP(G4S)2 663CO-T4his用于蛋白表达和性质鉴定。此外我们验证了 HIV-1转录反式激活因子(Transactivator of Transcription,Tat)共转HEK293T细胞对gp140蛋白表达的促进作用,并摸索得到最佳的Tat/gp140共转比例。镍柱纯化后,每升培养基可获得0.5mggp140蛋白,目的蛋白纯度约为70%。通过ELISA鉴定发现该重组蛋白具有良好的抗原活性,电镜下呈现均匀的三聚体结构。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,随着免疫次数增加小鼠血清中和能力逐渐提高,并最终筛选得到10株针对NL4-3毒株的中和单抗,其中两株具有型间交叉中和能力。本研究对B亚型HIV-1NL4-3gp140进行改造、优化转染条件,获得了 gp140三聚体在体外的高效表达,并对其抗原性和免疫原性进行了鉴定,探索了 HEK293系统表达gp140作为重组蛋白疫苗的可行性,为HIV-1包膜蛋白结构研究、疫苗和药物设计奠定基础。