前言皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）是起源于角质形成细胞或附属器鳞状上皮细胞的恶性肿瘤,是最常见的皮肤恶性肿瘤之一;具有侵袭性,易于转移。目前,SCC的治疗主要是手术切除（Mohs外科切除为佳）;然而,对于不适于接受皮肤外科治疗的患者（如非典型的皮肤癌前病变、损害发生于外阴等特殊部位、皮损数量较多面积较大难以难以手术治疗者,或者术后需要预防复发的患者）,选择适当有效的药物进行治疗具有十分重要的临床意义。研究表明维甲酸类化合物可以诱导皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的凋亡。维甲酸类化合物能通过调节一些抗凋亡基因（survivin,Bcl-2等）,促进某些肿瘤细胞凋亡,是近年来肿瘤治疗的热点之一。黄芩素（Baicalein）属于黄酮类化合物,是从常用的传统中药黄芩中提取的重要单体,是黄芩的主要有效成分之一。许多研究表明黄芩素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,影响细胞周期的分布（主要作用于G2-M相）,诱导凋亡。有体外实验证实黄芩素能诱导人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、胃癌细胞株SGC-7901、前列腺癌细胞、肺鳞癌、人白血病K562细胞、HL-60细胞和不成熟的骨髓瘤细胞发生凋亡。黄芩素对其中的某些肿瘤细胞的凋亡的诱导作用尚存在剂量效应关系。关于黄芩素在抗皮肤鳞癌方面的研究国内外均未见报道。本实验用黄芩素处理人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞,观察黄芩素对人皮肤鳞癌细胞生长的影响,并且以全反式维甲酸作为对照进一步探讨增殖抑制和诱导凋亡的作用;为临床应用黄芩素治疗皮肤鳞癌提供有价值的依据。材料和方法一、实验材料1、人皮肤鳞状细胞癌细胞系SCL-1（德国柏林自由大学本杰明.富兰克林医学中心惠赠）;HaCaT细胞（1998年由Fusenig等从正常人躯干皮肤中分离并培育的人KC细胞系,德国the Free University of Berlin大学惠赠）2、主要试剂和物品:黄芩素（Baicalein）;全反式维甲酸;RPMI-1640培养液;胎牛血清;0.25%胰酶;DMSO;四甲基偶氮唑蓝（MTT）;丫啶橙;Annexin-V/PI双染凋亡检测试剂盒。3、主要实验仪器:超净工作台;CO₂培养箱（Queue Systems2711,美国）;Microplate reader,全自动酶标读数仪;流式细胞仪（FACCALIBUR,BD.美国）;微型、超速离心机;深低温冰箱（SANYO,Altra Low日本）;倒置相差显微镜（OLYMPUS,I×70.日本）;荧光显微镜二、实验方法1、细胞培养SCL-1细胞和HaCaT细胞都使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养;培养条件统一在37℃,5%CO₂的培养箱;定期观察细胞的生长情况。2、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测SCL-1细胞以1×10⁵/mL接种于96孔板中,设立PBS对照组以及溶剂（DMSO）对照组,实验组为含有黄芩素12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,2×10^-5mol/L浓度的全反式维甲酸联合50μg/ml（均为终浓度）黄芩素,以及2×10^-5mol/L全反式维甲酸组总共8个组。在作用一定时间（12h,24h,48h）后,在96孔培养板中加入浓度为5mg/ml的MTT溶液20μL。放入37℃,5%CO₂的培养箱中培养4h,终止培养,取出96孔培养板,去孔内培养液,每孔加入DMSO200μL,用手轻轻震荡10min左右,使结晶物质充分溶解,用酶标仪测出各孔OD值,检测波长设定为570nm。以不含任何药物的溶液作为对照组。抑制率（IR）=（对照组OD值—实验组平均OD值）/对照组平均OD值*100%3、细胞形态学观察取25ug/ml黄芩素溶液以及浓度为2×10^-5mol/L全反式维甲酸作用48h的细胞,直接在倒置相差显微镜下观察实验组以及对照组细胞形态变化并摄相。4、流式细胞仪检测收集经浓度为25μg/ml,50μg/ml的黄芩素溶液作用12h、24h、48h的SCL-1细胞,PBS洗涤2次,弃上清,加入250μL结合缓冲液将细胞浓度调整至1×10⁶/ml,取100μL细胞悬液于5ml流式管中,分别加入5μLAnnexin V/FITC和10μL浓度20μg/ml的PI溶液,混匀后室温避光孵育10min,流式细胞仪检测细胞早期凋亡。结果用Cell Quest软件分析。5、丫啶橙荧光染色收集经50μg/ml黄芩素溶液作用48h的实验组SCL-1细胞,PBS洗涤1次,取95ul细胞悬液（1×10⁷/ml）加入5μL丫啶橙,混匀后吸1滴于洁净载玻片上,立即在490nm波长的荧光显微镜下观察。结果1、黄芩素对SCL-1及HaCaT细胞的增殖抑制作用本实验观察到,一定浓度的黄芩素对于SCL-1细胞的增殖有抑制作用,随着黄芩素药物浓度的升高,SCL-1细胞的存活率有所降低,具有一定的剂量依赖性。而对于HaCaT细胞的增殖抑制作用比较微小。2×10^-5mol/L浓度的全反式维甲酸对于SCL-1细胞也表现出一定的抑制作用。100μg/ml黄芩素溶液作用SCL-1细胞48h后增殖抑制率可以达到88.92%。2、显微镜下细胞形态学观察倒置显微镜下观察到,25μg/ml黄芩素溶液作用48h后SCL-1细胞体积稍微缩小,形态略不规则,部分细胞漂浮,有部分细胞死亡。HaCaT细胞形态无明显影响。用丫啶橙荧光染色,观察细胞凋亡的形态学变化;在荧光显微镜下观察到未加刺激因素的SCL-1细胞核呈黄绿色,细胞核较大,细胞浆为橙红色;50μg/ml黄芩素作用48h后,细胞形态大小不一,胞核固缩,有的细胞可以看到核碎裂,可见凋亡小体。3、流式细胞仪测定细胞早期凋亡50μg/ml黄芩素作用SCL-1细胞24h后,SCL-1细胞的凋亡现象较为明显,Cell Quest软件分析。结论1、黄芩素对于SCL-1细胞的增殖有抑制作用;随着作用时间的延长抑制效果更明显;存在剂量依赖关系。2、黄芩素可以诱导SCL-1细胞发生凋亡。3、黄芩素对于HaCaT细胞的生长抑制作用不明显;全反式维甲酸也可以抑制SCL-1细胞的增殖;一定浓度的黄芩素与全反式维甲酸联合作用对于SCL-1细胞的抑制增殖作用有协同效应。黄芩素对于SCL-1细胞的增殖有抑制作用要强于全反式维甲酸。