论文部分内容阅读
玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是我国传统名花之一,也是世界上广泛应用的天然香料植物,其花朵可提取玫瑰精油、制成玫瑰花茶,经济和保健价值极高。然而,玫瑰茎杆多皮刺,在田间的栽培管理和花朵采摘过程中存在诸多不便,因此,若能培育出少刺或者无刺的玫瑰品种,将极大提高玫瑰田间管理及采摘的工作效率,还能提高玫瑰的经济效益。本文以具有特异皮刺性状的’紫枝玫瑰’为试材,通过转录组测序分析鉴定紫枝玫瑰第一、二、三级侧枝中的差异表达基因,筛选调控玫瑰皮刺形成的候选基因,克隆获得了与玫瑰皮刺形成相关的RrCPC基因,并同源转化玫瑰验证其功能,旨在挖掘调控玫瑰皮刺形成和发育的关键基因,为进一步探明玫瑰刺形成与调控的分子机制奠定基础,也为今后通过基因工程手段减少玫瑰皮刺的形成、培育少刺或无刺玫瑰新种质奠定基础。主要研究结果如下:1.以’紫枝玫瑰’第一、二、三级侧枝的皮组织为材料,进行了转录组的测序,在除去低质量的reads后,分别从一、二、三级侧枝9组样品中获得超过98.22%的高质量clean reads,对获得的测序数据进行了组装、拼接,去冗余后得到87,071个Unigene。使用DEseq2方法进行差异基因检测和筛选,并进行DEG检测,发现三级侧枝两两对比均得到较多的差异基因。其中,一、三级侧枝的比对中差异基因最多,为3365个;二、三级侧枝的比对中差异基因最少,为923个。一、二级侧枝的比对中上调基因为324个,下调基因为1287个;一、三级侧枝的比对中上调基因为1660个,下调基因为1705个;二、三级侧枝的比对中上调基因为611个,下调基因为312个。利用功能注释,从差异倍数最大的30个基因中筛选出与玫瑰皮刺形成功能相关的7个基因。并进一步从’紫枝玫瑰’中同源克隆了与皮刺形成相关的RrCPC基因。2.采用荧光定量PCR技术研究了所挖掘的8个基因的时空表达规律。结果发现,在玫瑰侧枝皮组织发育的过程中,RrCPC基因在玫瑰一、二、三级侧枝中的表达量呈逐级递增的趋势;而MYB5基因的表达量呈逐级递减升趋势;CKX1基因在一级侧枝中的表达量最低,在二级和三级侧枝中的表达量相当;CKX6基因和bHLH130基因呈现逐渐下降的趋势;PHYB基因和WER基因在一级和二级侧枝中的表达量相当,在三级侧枝中的表达量最低;UF3GT基因表达量变化规律不明显,在一级到三级侧枝中的表达量呈现先上升再下降的趋势。3.分别构建了可能与玫瑰皮刺形成相关的RrCPC、RrWER和RrMYB5基因的表达载体并遗传转化玫瑰。结果表明,成功构建了 pCAMBIA1304-RrCPC过表达载体、pCas9-RrWER和 pCas9-RrMYB5 的 Crispr/Cas9 载体,以及 pCAMBIA1304 空载体。接着采用农杆菌介导的体细胞胚转化法将3个表达载体转入了 ’保白玫瑰’,经GUS染色和DNA验证等,初步获得pCAMBIA1304、RrCPC、RrWER和RrMYB5转基因体细胞胚。