背景和目的就全球范围而言,食管癌在各癌症发病率中排第八位,死亡率排第六位。据统计,2008年,全球新发482,300例,死亡406,800例。发病率在全球各地相差16倍左右。非洲东部和北部以及东亚地区是全球高发区,而西非、中非和中美洲则是低发区。男女发病比例在3：1到4：1之间。在过去半个世纪,食管癌发病率在西方国家持续增加。中国是食管癌的高发国,高发区发病率可高达100/100000以上。在中国,由食管癌导致死亡人数占了全球总死亡人数的70%以上。食管癌患者的5年总体生存率只有3%-10%。但对于癌症分期在Ⅰ期的患者,如果接受手术治疗后,5年生存率可提升至90%以上。因此食管癌的早诊早治极为重要。目前,食管癌的临床诊断主要依赖于内镜下的组织活检,但由于这种方法多是在病人出现明显的症状时检查,且操作具有创伤性,费用较高,及引起病人的不适等,结果待到明确诊断时,病人多已是肿瘤晚期。因此临床很有必要挖掘食管癌早期诊断标志物。众多研究已表明miRNAs表达失调与肿瘤发生、发展密切相关,miRNAs可作为肿瘤标志物对肿瘤具有诊断有价值。多种miRNAs已被发现在食管癌患者的组织和血浆内表达失调,但在唾液中表达水平及对食管癌的预测诊断价值如何,至今国内外未见研究报道。由于唾液血运丰富,唾液被认为是血循环的末端产物,很多血液中的分子物质也见于唾液中。所以唾液被喻为“人体健康的一面镜子(a mirror of the body’s health)",能反映机体的各种疾病状态,如癌症、感染性疾病和心血管疾病等。近年来也有研究报道组织、血浆和唾液三者具有相似的miRNA表达谱。同时,食管癌患者主要症状为吞咽困难和饮食后反流甚至呕吐,因此,患者口腔中可能残留由食管反流入口腔的癌细胞,增加了唾液miRNAs的含量和对食管癌检测的特异性。本研究分为筛查阶段和验证阶段。在筛查阶段中首先通过生物芯片技术筛选出在食管癌患者唾液中差异表达的靶miRNAs,然后在验证阶段中通过RT-PCR技术验证靶miRNAs的表达水平,探索其在食管癌中预测诊断价值。方法一、样本量估计在筛查阶段中,测得miR-144对食管癌的敏感性为85.7%数据见“数据----预实验”文件夹。根据样本量估计的公式n=(uα/22P(1-P))/δ2公式中病例组n为所需例数,u。/2为检验水准,α所对应的双侧正态分布界值,P为敏感性的预期值,δ为允许误差。根据本研究组获得标本的能力,检验水准取α=0.05(ua/2=1.96),δ取0.11。代入上述公式,得病例组所需例数n=1.962×0.857×(1-0.857)/0.152≈38.9=39。即本研究在验证阶段中,病例组需最少取39例。本研究最终取39例。按照本研究组获得标本的能力,设定病例组例数：对照组例数=39：19。,本研究最终取19例。二、对象选择随机收集2011年7月至2012年2月广东省人民医院收治的46例食管癌患者唾液上清标本。所有食管癌患者均经消化内镜活检病理证实,并且无伴发其他系统器质性疾病,如肝炎、糖尿病等。癌症分期按Umon for International Cancer Control(UICC)第七版指南标准划分。癌症分期为Ⅰ至Ⅲ期者由手术病理确定癌症分期。癌症分期为Ⅳ期者通过远处淋巴结穿刺活检或PET-CT检查确定分期。无法确定分期的患者是因患者拒绝接受治疗或进一步检查。以22例年龄、性别、种族匹配、无任何肿瘤病史的健康体检者作为正常对照组。所有研究个体均签署知情同意书。三、唾液收集在唾液收集前,研究个体需禁食、禁饮、禁烟和禁止口腔清洁2h以上。为增加唾液收集量,采用2%柠檬酸溶液湿润无菌棉签棉花头,然后将棉花头放于研究个体舌头一侧的后侧壁约5s,吐出唾液后,再将棉签放到另一侧的舌头后侧壁。如此反复收集。唾液收集量需达5ml以上,收集管使用50ml无菌无酶离心管。其中取2ml作全唾液标本,余下3ml唾液作唾液上清标本。同一研究个体都留有一份全唾液样本和一份唾液上清样本。唾液上清收集条件：4℃、3000g离心15min取上层上清至1.5ml Eppendoff管,再以4℃、12000g离心10min后再弃沉淀取上清。标本收集好后需2h之内作出处理。标本处理后均置-80℃保存。四、筛查阶段的芯片检测在食管癌组中随机选入7例全唾液标本和健康对照组中随机选入3例全唾液样本。两组个体在性别、年龄和种族上严格匹配。所入选的食管癌患者中,病理类型均为鳞癌,其中包括1例Ⅰ期、1例Ⅱ期、3例Ⅲ期,2例Ⅳ期。利用Agilent microarray技术,检测样品中923种miRNAs的表达水平。筛选出6个miRNAs是作为靶miRNAs进行后续的验证试验。筛选方法如下：因为gTotalGeneSignal相对于每个miRNA的表达值,因此对于同一种miRNA,利用此值作条形图。从条形图高低趋势判断最具表达差异的miRNAs作为靶niRNAs。由此筛选出5个靶miRNAs:miR-144、miR-10b*、miR-451、miR-486-5p、miR-634。此外,多项研究发现,miR-21在食管癌患者的病变组织和血浆中都显著高表达,因此虽然miR-21在芯片检测中没有显示出表达差异的趋势,但也入选进行分析。五、验证阶段对来自39例食管癌患者和19例正常对照的58份全唾液和58份唾液上清样本采用mirVana PARIS Kit (Ambion公司)试剂盒抽提唾液中的总RNA。取1ml唾液上清或全唾液,按照试剂盒的操作说明抽提总RNA,使用30μL无核酸酶水溶解RNA放-80℃保存。取2μLRNA进行反转录。取反转产物3μL作为模板,用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa公司)进行RT-qPCR检测,以miR-16为内参。所有反应采用3复孔。采用Biorad CFX962.1实时定量PCR仪进行检测。所测得的Ct值需同时满足以下三个条件,否则该反应需重做直至满足仨条件为止：①3复孔Ct值之间的标准差需小于0.5；②每个反应的溶解曲线波峰需单一；③每个Ct值需<36。miRNAs的表达量采用2-ΔΔCt表示[19]。即：标本iACt=标本iCtmiR-21-标本iCtmiR-16(内参)；标本iAACt=标本iACt-对照组ACt的平均值。六、数据处理采用SPSS13.0或MedCalc12.2.1统计软件进行处理。miRNA表达量和年龄两组组间差异使用Mann-Whitney U检验,三组间或以上比较使用Kruskal-Wallis H检验。性别组间差异使用卡方检验。对吸烟、酗酒、喝热饮、吃热食习惯和潮汕籍4项危险因素拟合Logistic回归模型,采用偏最大似然估计前进法(Forward LR)算出4项危险因素的相对危险度(Odds Ratio, OR).各OR值显著性检验采用卡方检验。应用ROC (Receiver Operating Characteristic)曲线评价诊断效能。使用Spearman相关性检验分析同一种miRNA在全唾液和唾液上清中表达水平的相关性。各靶niRNAs诊断效能的差异性比较使用MedCalcl2.2.1统计软件中的Delong法。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、唾液miRNA表达谱利用Agilent microarray技术,检测7份来自食管癌患者和3份健康人共10份全唾液样品中923种miRNAs的表达水平。结果发现有461种miRNAs在唾液中存在表达。其中食管癌标本发现452种,对照样本发现391种。有232种miRNAs在10份样本中都存在表达。其中有261种miRNAs在食管癌标本中存在表达,243种miRNAs在对照样本中存在表达。在所检查的miRNAs中,有25种miRNAs在食管癌组和健康对照组中存在差异性表达二、全唾液和唾液上清miRNA对食管癌的诊断价值根据microarray检测结果,挑选出miR-10b*、miR-144、miR-21、miR-451、miR-486-5p、miR-634为靶miRNAs分子。进一步采用RT-qPCR技术验证该6种发miRNAs的表达水平,发现现全唾液中的miR-10b*、miR-144、miR-451和唾液上清的miR-10b-3p、miR-144、miR-21、miR-451在患者组较对照组的表达水平明显上调。这7个指标在诊断食管癌的敏感性分别为：89.7%、92.3%、84.6%、79.5%、43.6%、87.2%、51.3%。特异性分别为：57.9%、47.4%、57.9%、57.9%、89.5%、47.4%、84.2%。三、不同ROC曲线下面积(AUC)的对比我们使用MedCalc12.2.1统计软件中的Delong法对各AUC进行差异性比较,全唾液miR10b*、miR-144、miR-451的AUC (P值分别为0.762、0.706、0.756)和唾液上清miR10b*、miR-144、miR-451的AUC (P值分别为0.702、0.682、0.725)差异性没有统计学意义；即同一种miRNA在全唾液和唾液上清中分别对食管癌的诊断价值差异性不显著。然后,对全唾液中对食管癌有诊断价值的3个miRNA miR10b*、miR-144. miR-451的AUC进行两两间比较。结果显示差异也均不显著。p值分别为0.2356(miR10b*VS miR-144)、0.8959(miR10b*VS miR-451)、0.3248(miR-144VS miR-451).最后,再对唾液上清中对食管癌有诊断价值的4个miRNA miR10b*、miR-144、miR-21、miR-451的AUC进行两两间比较。结果显示差异均不显著。p值分别为0.8251(miR10b*VS miR-21)、0.7699(miR10b*VS miR-451)、0.7102(miR10b*VS miR-144)、0.6079(miR-21VS miR-451)、0.8729(miR-21VS miR-144)、0.3529(miR-144VS miR-451)。四、全唾液与唾液上清miRNA表达水平的相关性每个研究个体均留有全唾液和唾液上清样本。上述结果显示miR10b*、 miR-144、miR-451在患者的全唾液和唾液上清中的表达水平均显著上调。利用Spearman相关性检验分析此3种miRNA在全唾液和唾液上清中表达水平的相关性。结果显示,3种miRNAs在全唾液和唾液上清中的表达水平均具有良好的正相关关系。p值分别为0.000(miR10b*)、0.035(miR-144)、0.003(miR-451)。结论唾液上清和未经离心的全唾液中均具有食管癌特征性miRNA,且具有一定的诊断参考价值。由于该技术无创性及和标本采集方便等特点,提示应进一步探索它们在食管癌高发区作为筛查食管癌新方法具有应用价值。