【摘 要】
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目的:1.利用Gateway技术构建各型FGFR2Ⅲc慢病毒表达系统;2.以此为基础初探FGFR2Ⅲc野生型及突变型对骨肉瘤细胞Saos-2、成肌细胞L6增殖和分化的影响。方法:1.通过RT-PCR获得FGFR2Ⅲc-WT基因,采用重叠延伸法进行S252W、S252W+P253R的突变,将上述获得的各基因克隆至慢病毒入门载体pENTA-11,利用LR重组酶,pENRY-FGFR2Ⅲc野生型及突变型
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目的:1.利用Gateway技术构建各型FGFR2Ⅲc慢病毒表达系统;2.以此为基础初探FGFR2Ⅲc野生型及突变型对骨肉瘤细胞Saos-2、成肌细胞L6增殖和分化的影响。方法:1.通过RT-PCR获得FGFR2Ⅲc-WT基因,采用重叠延伸法进行S252W、S252W+P253R的突变,将上述获得的各基因克隆至慢病毒入门载体pENTA-11,利用LR重组酶,pENRY-FGFR2Ⅲc野生型及突变型分别与慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,得到各型表达克隆。经鉴定后,脂质体法转染293FT细胞,获取重组慢病毒野生型及其突变型颗粒;2.经各重组慢病毒颗粒感染L6细胞和Saos-2细胞,杀稻瘟毒素Blastcidin筛选稳定表达各型FGFR2Ⅲc的重组胞株,Real-Time PCR法检测各型FGFR2Ⅲc基因的表达水平,Western Blotting检测各型FGFR2Ⅲc蛋白的表达;3.检测重组细胞株成肌分化、成骨分化情况:1)bFGF诱导L6各重组细胞,MTT法测定增殖情况,Real-Time PCR法检测分化相关基因（Myf5、myogenin、myosin）的表达水平,Western Blotting检测p38信号通路;2)bFGF诱导Saos-2各重组细胞,MTT法测定增殖情况,Real-Time PCR法检测分化相关基因（ALP、ColI、OPN）的表达水平,钙钴法染色和茜素红染色检测细胞成骨分化情况。结果:1.构建的FGFR2Ⅲc重组慢病毒表达载体鉴定正确,获得具感染性的重组慢病毒颗粒;2.重组慢病毒感染并筛选出重组Saos-2、L6细胞株,经PCR、Western Blotting的检测结果显示,FGFR2Ⅲc野生型及其突变型均在目标细胞中稳定过表达;3.对各L6重组细胞株的检测结果:1)在不同剂量的bFGF诱导24h后,MTT法检测显示过表达FGFR2Ⅲc-WT、M252基因的L6细胞增殖被抑制,而过表达M（252+253）基因的细胞增殖被促进;2)采用bFGF对各重组L6细胞株进行0,1,5,10,15,30,60,180分钟的诱导,并通过Real-Time PCR法检测各重组L6细胞株的成肌分化基因在不同诱导时间的的表达显示,与Control组相比,Myf5、myogenin、myosin的表达量均上调,且M252和M（252+253）基因对成肌细胞分化早期Myf5基因的促分化作用较明显,而WT基因则对成肌分化晚期基因myogenin、myosin的促分化作用较明显。其中,Myf5基因上调量最多为10倍,myogenin基因约9倍,myosin基因约13倍;3)采用bFGF对各重组L6细胞株进行0,1,5,10,15,30,60,180分钟的诱导发现,M252组在1min激活L6细胞MAPK途径的p38信号分子的磷酸化;WT组则在30min出现p38磷酸化现象;M（252+253）组则在0min时就出现p38磷酸化现象;而Control组无p38磷酸化现象。4.对各Saos-2重组细胞株的检测结果:1)在不同剂量的bFGF诱导24h后,MTT法检测显示过表达WT、FGFR2Ⅲc M252的Saos-2细胞增殖率下降,而M（252+253）的细胞增殖率上升;2)在bFGF诱导4周后,钙钴法染色和茜素红染色结果为:FGFR2Ⅲc-WT和M252均可促进Saos-2细胞成骨分化,且M252的促分化能力强于WT,而M（252+253）与Control组相比未见明显差异;3)采用bFGF对各重组Saos-2细胞株进行0,15,120,180min的诱导,通过Real-Time PCR法检测各重组Saos-2细胞株的促成骨分化基因ALP、ColI、OPN的表达显示:a)ALP基因:与Control组相比,M252组、M（252+253）组经bFGF诱导后ALP的表达逐渐上调,M252组在诱导120min后ALP表达达最高峰;b)ColI基因:与Control组相比,M252组、M（252+253）组经bFGF诱导后ColI的表达上调,M252组在诱导120min后ColI表达达最高峰;c)OPN基因:与Control组相比,实验组WT组、M252组、M（252+253）组经bFGF诱导后OPN的表达均逐渐上调;结论:成功构建表达FGFR2Ⅲc-WT、M252和M（252+253）突变型的重组慢病毒表达系统,并获得过表达上述基因的各重组细胞株;通过对L6和Saos-2重组细胞株的系列检测分析发现FGFR2Ⅲc-WT、M252、M（252+253）可促进L6成肌分化和Saos-2成骨分化,且M252的抑增殖和促分化能力更强。
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