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胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的一类原发恶性肿瘤,具有高复发率、高死亡率的特点,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)恶性程度最高,发病率约占所有胶质瘤患者的50%。由于其高度侵袭性生长的特点,临床预后极差。多年来,尽管在外科手术、化学药物疗法和放射疗法等的治疗方面取得了显著进展,但临床预后改善仍十分有限,中位生存时间无明显提高,依旧属于严重的公共卫生问题。近年来,在其他肿瘤分子靶向治疗方面取得的一些新的突破,也为胶质瘤治疗提供了新的思路,因此,有必要对其分子机制进行深入研究,为寻找合适的治疗靶点提供理论依据。胶质瘤的发生和发展与基因表达异常有关,而基因的表达水平受到多种机制调控,包括转录水平和转录后水平。基因的甲基化会干扰基因的转录水平,同时基因的最终表达水平也会在转录后水平调节,如通过调控信使RNA(message RNA,m RNA)的稳定性和降解水平来调节细胞中蛋白的表达。6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m~6A)是真核细胞中修饰m RNA的重要因子,可在转录后水平上调控基因的表达水平,而甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3,Mettl3)是调节m~6A的重要因子,已经有大量研究显示Mettl3具抑癌或者促癌作用,此外,Mettl3蛋白的表达水平也受到微小RNA(micro RNA,miRNA)的靶向调节。但是Mettl3在胶质瘤中的表达特点及其调控机制尚不完全明确。因此本文主要从体外细胞实验和动物体内实验两方面,分析Mettl3在胶质瘤细胞中的表达特点,以及Mettl3对胶质瘤细胞生物学行为的影响及其上下游调控机制。第一部分Mettl3在胶质瘤细胞中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响目的:主要分析Mettl3在人脑胶质瘤细胞中的表达特点及沉默或过表达Mettl3对胶质瘤细胞生物学行为的影响。方法:取人胶质瘤细胞系U87、LN229和正常人胶质细胞株HA1800,分别通过q PCR和Western blot检测Mettl3 m RNA和蛋白的表达水平。通过质粒转染的方法分别利用U87和LN229细胞构建Mettl3沉默或过表达的细胞模型,然后分别通过CCK-8法、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测沉默Mettl3或过表达Mettl3对细胞活力、增殖、迁移和和侵袭能力的影响,并通过流式细胞术检测沉默Mettl3或过表达Mettl3对细胞凋亡的影响。结果:在胶质瘤细胞中Mettl3 m RNA和蛋白的水平较正常人胶质细胞株HA1800均显著降低。沉默Mettl3会显著提高U87和LN229细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力,并抑制凋亡(P<0.05)。过表达Mettl3会抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进凋亡(P<0.05)。结论:在胶质瘤细胞中,Mettl3的表达水平均显著下调,沉默Mettl3会促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,并抑制凋亡,而过表达Mettl3具有抑癌作用,提示Mettl3在胶质瘤中可能发挥抑制细胞生长的作用。第二部分Mettl3通过PI3K/AKT/m TOR通路发挥抑制胶质瘤细胞生长的作用目的:通过体外和体内实验探讨Mettl3通过PI3K/AKT/m TOR通路调控胶质瘤进展的机制。方法:通过质粒转染的方法分别利用U87和LN229细胞构建Mettl3沉默或过表达的细胞模型,通过Western blot检测PI3K/AKT/m TOR通路中蛋白的磷酸化水平。然后分别使用LY294002和GSK690693来抑制PI3K和AKT蛋白,体外检测细胞活力和细胞迁移能力。然后利用过表达Mettl3的细胞构建荷瘤裸鼠模型,检测肿瘤体积和质量的变化,并检测肿瘤组织中PI3K/AKT/m TOR通路中蛋白的磷酸化水平。结果:沉默Mettl3会使PI3K、AKT和m TOR蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。使用LY294002和GSK690693抑制PI3K和AKT后,沉默Mettl3促进细胞活力和迁移的能力被显著逆转(P<0.05)。荷瘤裸鼠实验结果也显示过表达Mettl3会抑制U87和LN229细胞的成瘤能力,并且抑制PI3K、AKT和m TOR蛋白磷酸化水平(P<0.05)。结论:沉默Mettl3会显著提高PI3K/AKT/m TOR通路中蛋白的磷酸化水平,使用LY294002和GSK690693会阻断沉默Mettl3的促癌作用,提示在胶质瘤中,Mettl3的下调可能通过PI3K/AKT/m TOR通路起到促进细胞生长的作用。第三部分微小RNA-135b-5p对METTL3的靶向调控作用目的:探讨miR-135b-5p通过靶向调节Mettl3的表达调控胶质瘤进展的机制。方法:首先通过Starbase预测Mettl3上游的靶向miRNA,然后通过双荧光素酶报告验证miR-135b-5p与Mettl3信使RNA(message RNA,m RNA)的3’端的非翻译区域(3’-UTR)。然后分析人脑胶质细胞株HEB和胶质瘤细胞系U87和LN229细胞中miR-135b-5p的表达水平。通过共转染技术,在U87细胞分别构建mimic-NC、miR-135b-5p mimic和miR-135b-5p mimic+Mettl3组,LN229细胞分别构建inhibitor-NC、miR-135b-5p inhibitor组和miR-135b-5p inhibitor+sh-Mettl3组。通过q PCR和Western blot分别检测各组Mettl3 m RNA和蛋白的表达水平,并检测细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭能力。结果:预测结果显示miR-135b-5p可以与Mettl3 m RNA的3’-UTR区域结合,双荧光素酶报告结果验证了二者的靶向关系。细胞实验结果显示U87和LN229细胞中miR-135b-5p的水平显著高于HEB细胞(P<0.05),miR-135b-5p mimic组细胞中Mettl3m RNA和蛋白的水平显著降低(P<0.05),而过表达Mettl3可以逆转miR-135b-5p对Mettl3的抑制作用。miR-135b-5p mimic组的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力显著高增高而凋亡率显著降低(P<0.05),而过表达Mettl3会逆转miR-135-5p对细胞的促进作用。miR-135b-5p inhibitor组细胞中Mettl3 m RNA和蛋白的水平显著增高(P<0.05),沉默Mettl3可以逆转下调miR-135b-5p对Mettl3的促进作用。miR-135b-5p inhibitor组的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力显著降低而凋亡率显著增高(P<0.05),而沉默Mettl3会逆转下调miR-135-5p对细胞的抑制作用。结论:miR-135b-5p可通过靶向调控Mettl3对胶质瘤细胞产生抑制作用。